微流控等温扩增核酸定性与定量检测新方法研究

发布时间：2018-06-21 23:34

  本文选题：核酸检测 + 微流控　； 参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：具有高度多样性与特异性的核酸分子作为生物标志物能对不同种类生物物种、个体乃至单个基因进行识别与检测。2006年Nature杂志撰文提出了由世界卫生组织制定的满足发展中地区传染疾病诊断需求的ASSURED标准。依据此标准,近年来人们致力于解决核酸检测过程中的各项技术难点,简化操作步骤,提高检测性能与效率以及降低用户使用难度,使之满足现场即时检测的各项挑战。为解决现有核酸定性与定量检测方法中存在的不足与问题,尤其针对现场即时诊断应用中的局限,本文结合微流控技术与核酸等温扩增技术,研究了基于旋转反应芯片与离心式数字扩增芯片的环介导等温扩增核酸定性与定量可视化检测方法,将有可能为疾病诊断、生化分析、环境监测、法医鉴定以及食品安全等各个领域提供新型核酸分析技术平台。首先,建立了一种半封闭式的微流控旋转反应芯片平台,并将其成功应用于可视化环介导核酸等温扩增检测中。通过对芯片玻璃表面进行疏水修饰,实现了多种液样的载入与平行混合反应,避免了漏液以及交叉污染,并以荧光淬灭混合反应进行了方法验证与评价,成功表征了跨越近3个浓度数量级的荧光反应。自制了基于帕尔贴热电半导体的专用小型加热系统用以对芯片等温扩增进行温度快速控制与维持,可使芯片内样品5min之内达到反应温度。通过测试铜离子、纳米银以及pH条件对荧光指示剂淬灭效率的影响,优化及实现了可视化芯片等温扩增检测方法并达到了4～5倍的阳性/阴性荧光强度比,同时单孔反应试剂消耗体积降低至0.7μL。最后,系统探讨了环介导等温扩增检测中的产物污染管控问题,并确定了可消除检测假阳性的体系设置与操作模式。其次,在已建立的可视化芯片等温扩增检测方法基础上,针对包括蜡样芽胞杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、河流弧菌以及副溶血弧菌在内的五种消化道常见病原菌进行了定性检测研究。通过对包含内引物、脱氧核糖核苷三磷酸、嗜热脂肪芽孢杆菌核酸聚合酶、甜菜碱及镁离子在内的扩增体系主要成分进行芯片浓度优化扩增测试,确定了各组分最优化工作浓度。在这一反应条件下成功地实现了对河流弧菌的可视化芯片检测,获得了约7.2copies/μL的检测极限,同时验证了自行设计引物的良好特异性。最后,成功实现了多病原体的芯片可视化同步检测并且与芯片外常规等温扩增结果进行了对照,取得了不错的一致性。随后,基于泊松统计以及化学计量学基本理论,建立了数字等温扩增定量检测方法的数学模型,利用科学计算与可视化工具对该模型进行了蒙特卡洛模拟分析并验证了极大似然估计计算方法的有效性与可靠性。分别计算了扩增元数为1200与12000时数字定量方法的精度,准度与动态范围等技术参数,并基于理论计算将其与基于Ct值的实时定量方法进行了优劣比较并分析了两者的定量分辨率。最后,本文特别设计研制了用于核酸绝对定量检测的离心式数字扩增芯片并对样品离散化方式,温度控制以及防蒸发效果进行了测试与验证。该芯片扩增元体积及光强分布较为平均,变异系数分别为2.27%与0.676%,且完全能满足肉眼或便携光学传感器的检测需求,可有效降低核酸定量检测分析成本。最后,结合离心式数字扩增芯片以及可视化等温扩增方法对河流弧菌病原体载量进行测定。优化了反应温度,反应酶活,反应时间等扩增反应条件,并比较了不同成像条件对数字等温扩增定量结果的影响。该芯片方法能有效的对跨越4个数量级浓度的病原菌基因组核酸进行定量分析,结果与实时荧光定量结果一致。相较于本文的定性方法,检测极限进一步低至8.7×10-2copies/μL,检测时间缩短至40min,并且单次检测极具成本效益。通过结合定制的帕尔贴热电半导体加热器与便携光学传感器,该定量方法摆脱了对实时荧光检测器或热循环设备的依赖,满足了现场即时诊断的应用需求。
[Abstract]:A semi - closed microflow control rotary reaction chip platform is established , which can be used in the isothermal amplification of nucleic acid . The test and verification of the temperature control and the anti - evaporation effect are carried out . The amplification unit volume and the intensity distribution of the chip are average , the coefficient of variation is 2 . 27 % and 0 . 676 % respectively , and the effect of different imaging conditions on the quantitative result of digital isothermal amplification can be effectively reduced .
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q503;R440
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本文编号：2050521