茉莉酸信号途径中调控因子JAZ抑制MYC转录因子和调控茉莉酸脱敏反应的机制研究

发布时间：2018-06-22 04:02

本文选题：茉莉酸 + JAZ　；参考：《南京农业大学》2016年博士论文

【摘要】：植物激素茉莉酸(jasmonate,JA )不仅是植物抗病虫防卫反应的关键调控因子,也参与调控植物的生长发育。在植物正常生长发育条件下,JA浓度处在基础水平并且JA信号途径中关键的转录因子MYC的功能受到调控因子JAZ的抑制。当植物受到一定的外界环境压力,如病虫侵染时,体内迅速合成有活性的茉莉酸(JA-Ile),此时 JAZ 的功能转变为 JA 共同受体,与 SCF-type ubiquitin E3 ligase 中 F-box亚基COI1形成COIl-JA-Ile-JAZ复合体,由此导致JAZ蛋白的泛素化和依赖蛋白酶方式的降解,从而MYC蛋白从转录受抑制的状态下释放出来,并结合MED25转录激活因子,MED25招募RNA聚合酶Ⅱ到JA响应基因的启动子上。现阶段对于共同受体JAZ-COI1结合JA-Ile形成复合体的机制已经非常清楚了,但是对于调控因子JAZ如何抑制转录因子MYC的功能以及JAZ从植物正常生长发育状态下的转录抑制因子到JA防御基因激活状态下的JA共同受体的功能转换的机制,仍然不清楚。本文以MYC3和JAZ9两个蛋白作为研究对象,通过蛋白质结晶等手段解析并验证了两者的复合体晶体结构。首先通过活体酵母双杂交和离体Alpha Screen两种方法发现JAZ9蛋白的C端具有的17个氨基酸保守序列的Jas motif和MYC3蛋白N端包含JID和TAD domain的约200个氨基酸的区域是JAZ9-MYC3互作所必需的。此结果适用于JAZ和MYC蛋白家族中的其他成员。接下来对与JAZ9互作的MYC蛋白家族的MYC2,MYC3及MYC4共15个重组蛋白分别进行了纯化和结晶,获得了 MYC3(44-238)和MYC3(5-242)两个蛋白的高质量晶体,其X光衍射分别可以达到2.2 A和2.1A。通过单波长异常衍射(Se-SAD)的方法解析了硒蛋氨酸修饰过的MYC3(44-238)蛋白晶体结构Se-Met-MYC3(44-238)来解决MYC蛋白的相位问题,并以此为模板,利用分子置换的方法解析了 MYC3(5-242)的蛋白质晶体结构。在两个MYC3重组蛋白的晶体结构中,其N端均形成螺旋-折叠-螺旋的三明治状的层叠结构,在这个结构中,中心五个反平行的β折叠被结构中的α螺旋所包围。首次解析了转录因子酸性的TAD在非复合物状态下形成的“环-螺旋-环-螺旋”晶体结构,而MYC蛋白的JID包含β2折叠,α3螺旋及两段起连接作用的氨基酸序列。在MYC3(5-242)的结构中,JID与TAD中的α4螺旋形成一个槽状结构,MYC蛋白N端的α1螺旋与一个接近90°急剧弯曲的,局部向外伸展的α1'螺旋连接,α1'占据了由JID和TAD形成的槽状部位,且处于MYC结构中β折叠的顶部。在MYC3 N端不包含α1和α1'螺旋的截短的MYC3(44-238)晶体结构中,JID替代了 α1'在MYC3(5-242)结构中的槽状部位。为了解析JAZ-MYC复合体晶体结构,合成了一组包含JAZ1,JAZ8,JAZ9以及JAZ12不同长度的Jas motif多肽,与上述结晶筛选的MYC蛋白混合后进行共结晶,成功获得了 MYC3(44-238)与JAZ9的多肽Jas22JAZ9形成的复合体晶体。从MYC3(5-242)+Jas motif多肽的混合物中可以得到晶体,但结构解析证明仅是MYC3(5-242)单体。之后采取了氢氘交换(hydrogen deuterium exchange,HDX)实验检测了 MYC3(5-242)蛋白在水溶液中表面的可及性和结构动态,结果表明结构中间部位的β折叠非常稳定,而α1和α1'螺旋有很高的氘交换速率,说明其结构在溶液中是不稳定的状态,该结果与α1和α1'螺旋在MYC3(5-242)蛋白晶体结构中具有较高的B-factor相吻合。为了增加Jas motif多肽与MYC3(5-242)形成的复合体的稳定性,将这两个蛋白进行了融合,并成功地解析了 MYC3(5-242)-Jas22JAZ9复合体晶体结构。在MYC3(5-242)-Jas22JAZ9晶体结构中,Jas多肽形成一段连续的α螺旋,与MYC3的TAD和JID有着广泛的互作,Jas替代了 α1'螺旋在MYC3(5-242)蛋白晶体结构中的位置并成为MYC3 N端内部折叠中的一部分,同时MYC3的蛋白构象发生了很大的变化。相应地,JID螺旋重新安排了其位置并且α1和α1'螺旋完全成为无序序列,出现的这种无序序列可能是MYC3(5-242)/Jas22JAZ9复合体难以结晶的原因。在MYC3(44-238)+Jas22JAZ9复合体晶体结构中,Jas多肽也占据了 JID和TAD形成的槽状结构。总之,不管是MYC3的单体还是MYC-JAZ复合体的晶体结构均表明了槽状结构的占据(不管是MYC3单体中的α1'或JID螺旋,还是MYC-JAZ复合体中的Jas螺旋)是MYC蛋白N端总体折叠形成的关键。接下来通过酵母双杂交和拟南芥原生质瞬时表达实验验证了 JAZ-MYC复合体结构的正确性。值得注意的是Jas在COI1-JA-Ile-Jas复合体晶体结构中是一段部分结合茉莉酸的,部分伸展的螺旋,而在MYC-JAZ复合体结构中是一段连续的α螺旋。酵母双杂交结果表明COI1和MYC3可能竞争性结合Jas motif中间部分的氨基酸,但是JAZ9的C端到Jas motif之间的氨基酸能够促进JAZ9与COI1的互作,而对JAZ-MYC的互作则不关键。这些额外的互作可能是COI1驱动JAZ蛋白泛素化以及当JA-Ile水平上升的时侯,能够破坏JAZ-MYC蛋白广泛互作的原因。之前的研究证明MYC-TAD与MED25-ACID的结合是激活下游JA基因所必须的,然而在MYC-JAZ复合体结构中,除JID外,Jas还与MYC-TAD有关键的互作,以此推测JAZ蛋白和MED25蛋白与MYC3的结合部分可能是重叠的。Alpha Screen竞争实验和在烟草中同时瞬时表达MED25, JAZ9和MYC3并进行免疫沉淀的结果表明,JAZ蛋白的Jas motif和MED25的ACID很可能结合一段相同的MYC3表面结构域,并且在植物没有外界压力的情况下,JAZ竞争性地抑制MYC3-MED25的互作,这阻止了下游的转录反应,从而导致JA防御基因无法激活。本文还探索了 JAZ调控的植物茉莉酸脱敏反应的机制。从上述研究的研究结果可知,当植物感受到一定的外界压力的时候,体内会迅速合成有活性的茉莉酸并促使COIl-JA-Ile-JAZ复合体的形成,从而导致JAZ抑制因子的降解。随着植物的进化,JAZ10剪切突变体JAZ10.4缺失了野生型JAZ蛋白C端的Jas motif,但其N端包含了一段名为cryptic MYC-interacting domain (CMID)的结构域,同时存在于野生型JAZ1和JAZ10的N端。CMID的氨基酸序列与Jas motif不同,所以无法形成COI1-JA-Ile-JAZ复合体,但是仍然可以结合MYC3转录因子并行使JAZ蛋白转录抑制因子的功能。JAZ-MYC的结合抑制了植物茉莉酸防御基因的激活,从而导致植物对茉莉酸不再敏感。然而,CMID是如何结合并抑制转录因子MYC的分子机制仍然未知。通过酵母双杂交实验结果表明剪切突变体JAZ10.4除了 JAZ10的N端CMID区域以及MYC3包含JID和TAD的200个氨基酸的N端是JAZ10.4-MYC3互作所必需的。通过构建MYC3(44-242)和CMIDJAZ10及JasJAZ10两个蛋白的融合质粒,成功解析了 MYC3-CMIDJAZ10和MYC3-JasJAZ10两个复合体晶体结构。两个复合体的晶体结构的对比表明CMIDJAZ10在其复合体结构中的位置与JasJAZ10在MYC3-JasJAZ10中的位置相同,且均具有抑制MYC蛋白TAD的功能。然而,CMID在MYC3-CMID复合体结构中包含两个短α螺旋和两个环线状序列,较Jas与MYC3有着更为广泛的互作。CMID的N端短螺旋αl的位置与更长的Jas螺旋在MYC3-JasJAZ10复合体晶体结构中的位置重叠并且模仿了 Jas阻碍TAD的功能。通过酵母双杂交验证了MYC3-CMIDJAZ10结构的正确性,并发现JAZ和MYC3的氨基酸突变体中,单个氨基酸的突变不足以破坏JAZ-MYC3的互作。之后通过对复合体结构中CMID与MYC至少两个互作界面上的氨基酸的突变,发现JAZ10.4R37D/L54A以及MYC3Y97A/L125A和MYC3M155A/L125A可以完全破坏JAZ-MYC之间的互作,并且这些单突变体和双突变体经western blot检测都能够正常表达。Alpha Screen竞争实验结果表明CMIDJAZ10与MYC的结合能力强于JasJAZ10,几乎是其三倍。上述结果表明,CMID以与Jas相似的方式结合MYC3并抑制其TAD的功能,但是因为缺乏与COI1的互作,所以当植物体内JA-Ile浓度上升的时候,JAZ10.4会大量聚集并且重新抑制MYC,这作为脱敏反应的重要机制在植物信号动态平衡的重建过程中起着重要的作用。本文通过解析JAZ-MYC蛋白的复合体晶体结构揭示了在茉莉酸信号途径中,JAZ蛋白作为转录抑制因子抑制MYC-MED25的结合和调控茉莉酸脱敏反应,以及作为共同受体结合JA的角色转换的机制。
[Abstract]:The effects of JAZ - COI1 on the expression of JAZ - COI1 and MYC3 ( 5 - 242 ) were studied . In the crystal structure of MYC3 ( 5 - 242 ) - Jas22JAZ9 complex , the structure of MYC3 ( 5 - 242 ) - Jas22JAZ9 complex is very stable . The results show that the structure of MYC3 ( 5 - 242 ) / Jas22JAZ9 complex is difficult to crystallize . In conclusion , the structure of MYC3 ( 5 - 242 ) / Jas22JAZ9 complex is very stable . In conclusion , the structure of MYC3 ( 5 - 242 ) / Jas22JAZ9 complex is the key to the formation of MYC3 ( 5 - 242 ) / Jas22JAZ9 complex . The structure of MYC3 - CMIDJAZ10 and MYC3 - JasJAZ10 was studied by yeast two - hybrid experiment .
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q946

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