miR-144-3p在间充质干细胞增值、分化、凋亡过程中的调控作用研究

发布时间：2018-06-25 11:00

本文选题：间充质干细胞 + miRNAs　；参考：《华中农业大学》2016年博士论文

【摘要】：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是具有不断自我更新和多向分化潜能的基质细胞。在特定的诱导条件下,这些细胞能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。因此,在细胞再生医学上具有重要的临床意义。然而,调控间充质干细胞命运(细胞增殖、分化、凋亡)的分子机制尚不明确。miRNAs是内源性长度约为22 nt的单链RNA分子,通过靶向基因3'UTR调控其表达。近期研究表明,miRNAs参与调控多种生理生化过程,其中包括细胞增殖、分化以及凋亡。miR-144-3p是一个典型的癌症抑制因子且参与多种癌症或肿瘤细胞的增殖调控。然而,截止目前,还没有关于miR-144-3p调控间充质干细胞增殖与分化的文献报道。因此,本研究主要通过功能“获得”和“缺失”、双荧光素酶报告基因检测、荧光定量PCR、 Western blotting、实时细胞分析以及流式细胞等方法对miR-144-3p在间充质干细胞增殖、分化以及凋亡过程中的作用进行了研究,主要研究结果如下：1. miR-144-3p对间充质干细胞成骨分化的调控作用在小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,成骨分化标志基因(Runx2、OCN和Osx)的表达量逐渐升高。而miR-144-3p的表达量则逐渐降低,到诱导成骨21d的时候达到最低。这表明miR-144-3p可能参与调控小鼠间充质干细胞成骨分化过程。将miR-144-3p mimics(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后诱导成骨分化。结果发现miR-144-3p mimics转染组细胞成骨分化显著受到抑制,ALP以及茜素红染色和定量结果均显示：miR-144-3p mimic s转染组细胞ALP活性降低、钙结节形成受到抑制。另外,qRT-PCR和Western blotting结果也表明：miR-144-3p mimics转染组细胞成骨分化标志基因Runx2、OCN以及Osx的表达量显著下降。相应地,我们将miR-144-3p inhibitor(或者是其阴性对照)转染C3H10T1/2细胞,然后诱导成骨分化,结果与转染miR-144-3p mimics呈现相反的趋势。因此,miR-144-3p抑制C3H10T1/2细胞成骨分化。通过多种靶基因预测软件预测发现：Smad4可能是miR-144-3p的靶基因。双荧光素酶报告试验、qRT-PCR、Western blotting进一步证实,miR-144-3p直接靶向Smad4 3'UTR,且在转录后水平抑制其表达。进一步研究靶基因Smad4功能发现：①在C3H10T1/2细胞中超表达Smad4能够促进其成骨分化,而抑制Smad4表达则会抑制C3H10T1/2细胞成骨分化。②在C3H10T1/2细胞中,通过si-Smad4抑制Smad4表达将会阻断miR-144-3p inhibitor对于C 3H10T1/2细胞成骨分化的促进作用。这也进一步表明,Smad4作为miR-144-3p的靶基因,是连接miR-144-3p与C3H10T1/2细胞成骨分化的桥梁。因此,miR-144-3p是通过靶向调控Smad4来抑制C3H10T1/2细胞成骨分化的。2. miR-144-3p对间充质干细胞成脂分化的调控作用在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中,成脂分化标志基因(C/EBPα、C/EBPβ、 PPARy以及AP2)的表达量逐渐升高,而且miR-144-3p的表达量也随着成脂分化过程逐渐升高,到诱导成脂8d的时候达到最高。这表明niR-144-3p可能参与调控小鼠间充质干细胞成脂分化过程。将miR-144-3p mimics(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后诱导成脂分化。结果发现,miR-144-3p mimics促进细胞成脂分化。miR-144-3p mimics转染组油红O染色结果比阴性对照组要显著升高,同时成脂分化标志基因C/EBPα、 C/EBPβ、PPARy以及AP2的表达量也明显升高。相应地,我们将miR-144-3p inhibitor(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后诱导成脂分化,结果与转染miR-144-3p mimics呈现相反的趋势。这些结果表明：miR-144-3p促进C3H10T1/2细胞成脂分化。通过多种靶基因预测软件预测发现：bmp-3b可能是miR-144-3p调控成脂分化过程中靶向的基因。双荧光素酶报告试验、qRT-PCR、Western blotting进一步证实,miR-144-3p直接靶向bmp-3b的3'UTR,且在转录以及转录后水平抑制其表达。3. miR-144-3p对间充质干细胞增殖和凋亡的调控作用将]miR-144-3p mimics(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,然后通过实时细胞分析仪监测细胞增殖情况。结果发现,miR-144-3p mimics显著抑制细胞增殖。相应地,我们将miR-144-3p inhibitor(或者是其阴性对照)转染到C3H10T1/2细胞中,实时细胞分析结果与转染miR-144-3p mimics呈现相反的趋势。通过流式分析进一步证实了miR-144-3p对C3H10T1/2细胞增殖的负调控作用：在转染了miR-144-3p mimics后,G0/G1期细胞显著增多,而S期细胞显著减少,这表明miR-144-3p mimics会阻滞C3H10T1/2细胞于G0/G1期：而转染niR-144-3pinhibito r则得到相反的结果。因此,miR-144-3 P通过阻滞C3H10T1/2细胞于G0/G1期,抑制C3H10T1/2细胞增殖。已经证实,miR-144-3p靶向抑制Smad4基因。进一步研究靶基因Smad4功能发现：①在C3H10T1/2细胞中超表达Smad4能够促进其增殖,而抑制Smad4表达则会抑制C3H10T1/2细胞增殖。②在C3H10T1/2细胞中共转染si-Smad4与miR-144-3p inhibitor, miR-144-3p inhibitor对于C3H10T1/2细胞增殖的促进作用消失。这也进一步表明,niR-144-3p通过靶向调控Smad4抑制C3H10T1/2细胞增殖。为探究miR-144-3p对于C3H10T1/2细胞凋亡的影响,我们将1miR-144-3p mimics(或者是miR-144-3p inhibitor)转染到C3H10T1/2细胞中,通过流式分析转染后细胞凋亡情况。结果发现,miR-144-3p mimics和miR-144-3p inhibitor都不影响C3H10T1/2细胞凋亡。同时,我们检测凋亡相关蛋白的表达发现niR-144-3p也不影响凋亡相关蛋白的表达。因此,我们推断miR-144-3p对间充质干细胞凋亡不起作用。综上所述,本研究的结论是：① miR-144-3p通过靶向Smad4抑制C3H10T1/2细胞成骨分化,Smad4基因促进C3H10T1/2细胞成骨分化过程；②miR-144-3p通过靶向bmp-3b促进C3H10T1/2细胞成脂分化；③miR-144-3p通过靶向Smad4抑制C3H10T1/2细胞增殖,Smad4基因促进C3H10T1/2细胞增殖过程：④miR-144-3p不影响C3H10T1/2细胞凋亡。
[Abstract]:However , there is no literature report on the proliferation , differentiation and apoptosis of the mesenchymal stem cells by targeting gene 3 ' . However , the present study has not yet done a study on the role of miR - 144 - 3P in the proliferation , differentiation and apoptosis of mesenchymal stem cells . Conclusion : The expression of miR - 144 - 3P can promote the differentiation of bone differentiation in C3H10T1 / 2 cells . The results also show that miR - 144 - 3P can be involved in regulating bone differentiation in C3H10T1 / 2 cells . The results showed that miR - 144 - 3P may be involved in the regulation and regulation of adipogenesis in C3H10T1 / 2 cells . The results show that miR - 144 - 3P can be involved in the regulation of adipogenesis in C3H10T1 / 2 cells . The results showed that miR - 144 - 3P inhibited the proliferation of C3H10T1 / 2 cells by targeting Smad4 . The results showed that miR - 144 - 3P inhibited the proliferation of C3H10T1 / 2 cells .
( 2 ) miR - 144 - 3P promotes the differentiation of C3H10T1 / 2 cells through targeting bmp - 3b ;
( 3 ) miR - 144 - 3P inhibits the proliferation of C3H10T1 / 2 cells by targeting Smad4 , and the Smad4 gene promotes the proliferation of C3H10T1 / 2 cells : ( 4 ) miR - 144 - 3P does not influence the apoptosis of C3H10T1 / 2 cells .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q23

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