人间充质干细胞生物学特性及免疫抑制作用机制的研究

发布时间：2016-12-17 21:28

  本文关键词：人间充质干细胞生物学特性及免疫抑制作用机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

人间充质干细胞生物学特性及免疫抑制作用机制的研究

李秀英  

【摘要】：间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell; MSC）是一类存在于多种组织中并具有自我复制及多向分化潜能的细胞。最初由Friedenstein等在骨髓中发现，随后在其他组织中陆续发现MSC的存在，如脂肪组织、脐带华顿氏胶、胎盘组织等。MSC不仅具有较强的增殖能力和多向分化能力，还具有免疫抑制作用，可以抑制同种异体组织移植所引起的免疫排斥反应，延长移植物生存时间。这些特性使MSC在治疗免疫系统疾病及组织、器官移植中有重要的应用价值。由于目前关于MSC免疫抑制作用的机制尚不是十分清晰，尤其对T淋巴细胞增殖抑制作用机制存在较大争议，因此不能保证MSC的临床应用效果及临床治疗的安全性。鉴于此，本研究选取了MSC中来源广泛且容易获得的骨髓间充质干细胞（BM-MSC）、脂肪间充质干细胞（AT-MSC）、脐带华顿氏胶间充质干细胞（WJ-MSC）和胎盘间充质干细胞（PL-MSC），比较其生物学特性并挑选出对于修复组织损伤更有优势的MSC；在此基础上，进一步研究该MSC免疫抑制作用的分子机制。以上研究可为MSC更安全有效的进行医学等领域的应用提供基础理论及实验依据。 1．人BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC的分离、培养及鉴定 目的：采用一种简单有效地分离培养BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC的方法，并观察其形态，检测细胞表面抗原的表达及其成脂、成骨的能力，为后续的实验提供充足的干细胞材料。方法：采用酶消化法分离提纯AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，采用全骨髓组织贴壁法分离提纯BM-MSC；通过倒置显微镜对细胞形态进行观察；运用流式细胞仪检测两种分离方法得到的四种细胞表面抗原的表达；对四种MSC的多向分化潜能进行检测，包括成脂和成骨能力。结果：消化法可以成功分离出AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，全骨髓组织贴壁法也可以分离获得BM-MSC，四种MSC均呈纤维细胞样贴壁生长；对细胞表面抗原进行检测，发现四种细胞的表达情况类似，均能阳性表达CD44、CD73、CD90和CD105等MSC的表面抗原，而不表达CD14、CD34和CD45等血液和内皮系统的表面抗原；通过对四种MSC多向分化能力的检测，发现四种细胞均具有成脂和成骨的能力；以上结果均符合国际细胞治疗学会对MSC的定义和标准，说明从上述组织中分离出的细胞均符合MSC的特性。结论：成功分离出BM-MSC、AT-MSC、WJ-MSC和PL-MSC，且细胞符合MSC的标准，包括细胞形态、细胞表面抗原的表达情况和多向分化的能力，适用于后续实验。 2．四种MSC的分化及增殖能力对比 目的：比较四种MSC的增殖能力、成脂及成骨的分化能力。方法：采用活细胞计数方法检测四种MSC增殖能力；运用流式细胞技术检测四种细胞的细胞周期；采用成脂和成骨诱导分化试剂盒诱导分化MSC；采用成脂细胞计数方法检测四种MSC成脂分化能力，利用骨结节分析的方法检测四种MSC成骨分化能力。结果：WJ-MSC的增殖能力最强（P0.001），其次为：AT-MSC、PL-MSC和BM-MSC；AT-MSC的成脂能力最强（P0.001），其次为：WJ-MSC、BM-MSC和PL-MSC；WJ-MSC的成骨能力最强（P0.001），其次为：PL-MSC、AT-MSC和BM-MSC。结论：WJ-MSC具有较强的增殖能力和成骨分化能力，AT-MSC具有较强的成脂能力。 3．MSC对T淋巴细胞的抑制作用及其分子机制研究 3.1四种MSC对T淋巴细胞的抑制作用 目的：比较四种MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用。方法：采用共培养（MSC与T淋巴细胞共培养比例为1:1、1:5、1:10、1:20、1:50）和Brdu方法检测不同数量MSC对植物血凝素（PHA）激活的T淋巴细胞增殖能力的抑制作用。结果：四种MSC均明显抑制T淋巴细胞增殖，且呈细胞数量依赖性，WJ-MSC、AT-MSC和PL-MSC抑制能力均强于BM-MSC（P0.05），且WJ-MSC的抑制作用最强。结论：四种MSC对T淋巴细胞的增殖能力有抑制作用，且WJ-MSC对T淋巴细胞增殖能力的抑制作用较强。 3.2共培养体系中WJ-MSC的吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达及活性 目的：检测与T淋巴细胞共培养后WJ-MSC的IDO表达水平及其活性，观察IDO与T淋巴细胞增殖能力之间的关系。方法：通过RT-PCR及Western blot方法检测与T淋巴细胞共培养后WJ-MSC的IDO基因表达；高效液相色谱串联质谱联用仪（HPLC-MS/MS）检测共培养体系中IDO的活性及1-甲基色氨酸（1-MT）对IDO的中和作用；用ELISA试剂盒检测共培养上清液中IFN-γ的含量。结果：ELISA结果显示单独培养的WJ-MSC不分泌IFN-γ，而激活后的T淋巴细胞分泌大量的IFN-γ并刺激共培养中的WJ-MSC表达IDO；WJ-MSC反过来抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ；RT-PCR、Western blot及HPLC-MS/MS结果显示共培养后的WJ-MSC表达有活性的IDO，且其活性明显高于对照组（P0.001）；共培养体系中加入IDO的活性抑制剂1-MT后，T淋巴细胞的增殖能力恢复81%以上。结论：被激活的T淋巴细胞分泌IFN-γ，且通过IFN-γ诱导WJ-MSC表达有活性的IDO；有活性的IDO抑制T淋巴细胞增殖，推断IDO是MSC发挥免疫抑制作用的机制之一。 3.3WJ-MSC阻滞T淋巴细胞周期进程 目的：探讨WJ-MSC对T淋巴细胞抑制作用的分子机制。方法：共培养体系中分别加入或不加入IDO抑制剂1-MT，采用细胞周期检测试剂盒检测T淋巴细胞的细胞周期；qRT-PCR检测相关基因mRNA水平。结果：WJ-MSC阻滞T淋巴细胞的G1→S期进程，处于G0/G1期细胞数量增多，其SPF值、PI值小于对照组（P0.001）；与对照组相比，，共培养组T淋巴细胞的增殖相关基因CDK4的mRNA水平下调（P0.001）；加入1-MT后T淋巴细胞的S期细胞数几乎恢复到对照组水平，同时增殖相关基因CDK4的mRNA几乎恢复到对照组水平。结论：WJ-MSC对T淋巴细胞增殖的抑制是通过表达有活性的IDO下调T淋巴细胞CDK4的基因水平并阻滞其细胞周期G1→S期进程来实现的。 3.4WJ-MSC促进T淋巴细胞凋亡 目的：分析WJ-MSC对T淋巴细胞凋亡的影响及相关基因的表达情况。方法：共培养体系中分别加入或不加入IDO抑制剂1-MT，采用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡；qRT-PCR检测相关基因mRNA水平。结果：与对照组相比，WJ-MSC能够促进T淋巴细胞凋亡（P0.001），凋亡率为（22.8±1.6）%；与对照组相比，共培养组T淋巴细胞的抑制凋亡基因Bcl2下调而促凋亡相关基因Caspase3上调（P0.001）；加入1-MT后T淋巴细胞的凋亡率几乎恢复到对照组水平，同时凋亡相关基因的mRNA几乎恢复到对照组水平。结论：WJ-MSC通过表达有活性的IDO促进T淋巴细胞凋亡，并且是通过Bcl2/caspase途径诱导T淋巴细胞凋亡。 4．与WJ-MSC共培养的T淋巴细胞内参基因的筛选 目的：评价与WJ-MSC共培养的T淋巴细胞内参基因的稳定性。方法：选择18S、GAPDH、ACTB、PPIA、B2M、RPL13A、HPRT1和TBP8种内参基因，采用geNorm、NormFinder和BestKeeper这3个软件全面评价与MSC共培养后的T淋巴细胞的内参稳定性。结果：B2M是理想的稳定内参基因，而常用的内参基因如ACTB和GAPDH，在T淋巴细胞实验中并不是理想的稳定内参基因。结论：在与WJ-MSC共培养的T淋巴细胞相关实验中，B2M是较理想的稳定内参基因。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 叶明珠;刘爱民;韩丽英;李荷莲;董玉洁;;人早期胚胎源性间充质干细胞的体外分离培养及其生物学特性[J];吉林大学学报(医学版);2007年04期

2 仵敏娟,刘善荣,刘厚奇 ,惠宁,杨玲,王凤玫,汤淑萍;人早期胚胎间充质干细胞的定位和体外初步分离培养[J];第二军医大学学报;2004年08期

3 枟涛;秦书俭;王超;任广达;裴丹;;年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响[J];辽宁医学院学报;2009年01期

4 高燕,林莉萍,丁健;细胞周期调控的研究进展[J];生命科学;2005年04期

5 孙国栋;李志忠;;人脐带间充质干细胞在组织工程中的研究进展[J];现代生物医学进展;2009年12期

6 秦秀军;张伟;李建国;魏锦萍;阚卫军;李荣荣;;人脂肪间充质干细胞的致瘤性研究[J];天津医药;2013年02期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 熊伟;陈贵元;何敏;马明星;余敏;谭德勇;;人细胞周期素D1和B1真核表达载体的构建及对HeLa细胞的转染[J];癌变·畸变·突变;2011年05期

2 唐永凯;李建林;李红霞;陈雪峰;俞菊华;;奥利亚罗非鱼EF-1α基因的克隆与结构分析[J];动物学杂志;2008年05期

3 叶明珠;刘爱民;韩丽英;李荷莲;董玉洁;;人早期胚胎源性间充质干细胞的体外分离培养及其生物学特性[J];吉林大学学报(医学版);2007年04期

4 李宁;;低氧微环境对间充质干细胞增殖、分化影响的研究进展[J];重庆医学;2010年08期

5 朱峰;胡贞贞;郭光华;;肺外成体干细胞移植治疗急性肺损伤研究进展[J];第二军医大学学报;2009年06期

6 熊伟;陈贵元;何敏;左绍远;;人细胞周期蛋白cyclin E基因的克隆与真核表达载体的构建[J];大理学院学报;2011年06期

7 李丽芳;贾球锋;张映;聂向庭;;禽胰多肽对肉鸡肝脏和小肠组织中APPR mRNA表达量影响的研究[J];动物营养学报;2009年01期

8 董晓丽;王加启;卜登攀;张春林;李珊珊;赵国琦;;内参基因在实时定量PCR中应用的研究进展[J];中国畜牧兽医;2009年09期

9 肖翠;严佳文;龙桂友;戴素明;李大志;邓子牛;;柑橘内参基因的稳定性评价[J];果树学报;2012年06期

10 周正丽;张潜;;激素性股骨头坏死中骨细胞凋亡的研究进展[J];重庆医学;2012年34期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 范兰芬;钟杨生;林健荣;;家蚕细胞周期蛋白Bmcyclin基因的克隆及分析[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集（1）[C];2009年

2 任广睦;赵晋芳;梁新华;黄新宇;;死亡人体胸肌组织中rRNA亚基的稳定性[A];全国第九次法医学术交流会论文集[C];2013年

3 陈常辉;余方圆;;干细胞关节腔内注射修复软骨损伤的研究与进展[A];中国医药教育论坛-中国医药教育协会第三届三次理事大会暨学术年会论文专辑[C];2013年

4 孙中厚;刘钢铁;张倩;季佳芬;王立杰;;骨髓间充质干细胞对内毒素急性肺损伤大鼠CD4~+CD25~+Foxp3~+Tregs的作用[A];《中华急诊医学杂志》第十二届组稿会暨第五届急诊医学青年论坛论文汇编[C];2013年

5 陈希;李国平;;黄芪在干预细胞凋亡方面的研究进展[A];江西省第八次中西医结合危重病、急救医学学术研讨会论文集[C];2013年

6 Qinjun Zhao;Hongying Ren;Zhongchao Han;;Mesenchymal stem cells: Immunomodulatory capability and clinical potential in immune diseases[A];第十四届全国肿瘤生物治疗大会论文集[C];2015年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨丽红;柑橘全爪螨Panonychus citri（McGregor）对热胁迫的响应机制研究[D];西南大学;2011年

2 赵王林;淫羊藿苷对骨质疏松大鼠MSCs定向分化干预的实验研究[D];广州中医药大学;2011年

3 林玉玲;龙眼体胚发生过程中SOD基因家族的克隆及表达调控研究[D];福建农林大学;2011年

4 姜山;猫眼草活性成分提取物的肺癌抑制作用及其机制研究[D];中国海洋大学;2011年

5 王芸;pH、氨氮胁迫对中国对虾细胞凋亡和抗氧化系统影响机理的研究[D];上海海洋大学;2011年

6 王顺才;两种苹果砧木对干旱的响应机理及抗性基因表达分析研究[D];西北农林科技大学;2011年

7 周琳璘;TaMS-MADSbox和TaG3BP基因在小麦温敏雄性不育系育性转换中的功能分析[D];西北农林科技大学;2011年

8 李红华;人胚胎间充质干细胞向平滑肌细胞分化体外模型的建立及分化机制初探[D];第二军医大学;2004年

9 杜海英;镉抗肿瘤作用及其相关机制的研究[D];吉林大学;2006年

10 彭丹冰;苯代谢产物对幼鼠骨髓细胞损伤作用及其机制研究[D];吉林大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 曹明勇;骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠左心室功能和室性心律失常的影响[D];南京医科大学;2010年

2 徐红伟;兰州大尾羊脂肪代谢功能相关基因mRNA时空表达规律的研究[D];西北民族大学;2010年

3 王雯霞;神经生长因子和通心络对骨髓间充质干细胞血管新生能力的影响[D];浙江大学;2011年

4 王桐;长牡蛎(Crassostrea gigas) cdk1和cyclin B3基因的克隆及其在性腺发育中作用的初步研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2011年

5 姚银竹;c-jun对基础状态下仔猪睾丸间质细胞增殖的影响[D];西南大学;2011年

6 张曦;NF-κB、Bc1-2、TGF-β1在酒精性脂肪肝患者血清中的表达及相关性[D];兰州大学;2011年

7 侯娟娟;辣椒素经内质网应激途径诱导白血病细胞凋亡和对白血病干细胞的影响[D];兰州大学;2011年

8 杨靓;绞股蓝总皂苷诱导小鼠白血病L1210细胞凋亡及机制探讨[D];陕西师范大学;2011年

9 王君;干细胞移植治疗18例低功能型孤独症临床疗效分析[D];安徽医科大学;2011年

10 马金玉;龙眼体胚发生过程中若干PCD相关基因的克隆及表达[D];福建农林大学;2011年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 仵敏娟,刘善荣,刘厚奇 ,惠宁,杨玲,王凤玫,汤淑萍;人早期胚胎间充质干细胞的定位和体外初步分离培养[J];第二军医大学学报;2004年08期

2 路艳蒙,傅文玉,朴英杰;人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定[J];第一军医大学学报;2001年08期

3 弓娟琴;Fas介导的凋亡与caspase家族[J];国外医学.皮肤性病学分册;2001年05期

4 庄淑波;刘毅;;骨髓间充质干细胞在整形外科的应用前景[J];中国美容医学;2006年03期

5 庄淑波;刘毅;;大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂分化能力的实验研究[J];中国美容医学;2006年11期

6 李彩霞;梁志清;王凤英;李玉艳;何畏;俞炽阳;;脐带多能干细胞的分离与鉴定[J];免疫学杂志;2008年05期

7 孟淑芳;林林;李修兰;冯建平;王佑春;李德富;;软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比较[J];中国生物制品学杂志;2006年05期

8 林晓波;何红燕;罗敏洁;崔冰琳;冯学永;蒋学武;谢庆东;黄天华;应文娟;马廉;;人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究[J];实用儿科临床杂志;2007年13期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王勤,兰永胜,张玉兰,吴绍祖;二氯二茂钛的免疫抑制作用[J];甘肃科学学报;1993年01期

2 范传波,艾辉胜;骨髓间充质干细胞免疫抑制作用及其机理[J];生物技术通讯;2005年04期

3 ;传染性法氏囊病病毒的免疫抑制作用[J];中国兽药杂志;1998年01期

4 王金泉,刘志红;糖皮质激素免疫抑制作用机理的新认识[J];肾脏病与透析肾移植杂志;1997年02期

5 金永柱,谢蜀生;CTLA-4-FasL双功能分子的构建及其体外免疫抑制作用的研究[J];北京大学学报(医学版);2001年06期

6 周璟,马宝骊,张家胜,王利,韩晓枫,张继英,柏峻;CTLA4Ig融合蛋白体外免疫抑制作用机制探讨[J];上海免疫学杂志;2001年04期

7 潘兴华,王水琴,陈志龙,黄丽娜;阻断糖皮质激素受体的雏鸡抵抗地塞米松诱导的免疫抑制作用[J];细胞与分子免疫学杂志;1999年01期

8 朱云凤;陈广洁;高惠宝;程丽萍;王一飞;;人类精液中酸性磷酸酶的研究——Ⅱ.酸性磷酸酶对巨噬细胞的免疫抑制作用[J];男性学杂志;1992年03期

9 王易伦,万芷芳,苏成芝;免疫豚鼠TF对人AFP免疫抑制作用的对抗效应及其特征[J];第四军医大学学报;1985年03期

10 刘述先,吴公责,潘彩娥;血吸虫感染宿主免疫抑制现象的研究 Ⅱ.日本血吸虫感染鼠血清的免疫抑制作用[J];上海免疫学杂志;1984年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 赵晓甦;刘开彦;刘代红;许兰平;陈欢;黄晓军;;血浆中吲哚2,3双加氧酶在异基因造血干细胞移植后急性移植物抗宿主病中的免疫抑制作用[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

2 周华丽;谢强敏;沈文会;夏靖燕;林晓霞;;格瑞三号油抗炎免疫抑制作用的机理探讨[A];第七届中国抗炎免疫药理学术会议论文摘要集[C];2000年

3 皮先明;李恒;龙剑文;金晶;;中药的免疫抑制作用在皮肤科的应用[A];中华中医药学会皮肤科分会第七次学术年会、2010年重庆四川中西医结合皮肤性病学术年会、全国中西医结合诊疗皮肤性病新进展新技术学习班论文汇编[C];2010年

4 皮先明;;中药的免疫抑制作用在皮肤科的应用[A];中华医学会第16次全国皮肤性病学术年会摘要集[C];2010年

5 潘华新;王培训;周联;曹柳英;梁瑞燕;;两种雷公藤多苷片抗炎、免疫抑制作用的对比研究[A];第三届全国中医药免疫学术研讨会论文汇编[C];2006年

6 赵世萍;陈玉武;郭景珍;付桂香;龚海洋;李克明;;山茱萸总甙的抗炎免疫抑制作用研究[A];中国自然资源学会全国第二届天然药物资源学术研讨会论文集[C];1997年

7 李怡棠;白金叶;刘柏合;关慕贞;程桂芳;;GZR-98免疫抑制作用研究[A];第八届全国生化药理学术讨论会暨第七届Servier奖颁奖大会会议摘要集[C];2003年

8 王永福;常志芳;王慧;赵义;李茹;栗占国;;硫酸长春地辛免疫抑制作用的实验研究[A];全国临床免疫检验研讨会暨第六届全国临床免疫学术会议论文汇编[C];2009年

9 崔激;王润田;王智华;王平;;黄芪下调Colon26肿瘤细胞免疫抑制作用的体外研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

10 崔澂;王润田;王智华;王平;;黄芪下调Colon26肿瘤细胞免疫抑制作用的体外研究[A];河北省免疫学会第5次会员代表暨学术大会论文摘要集[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 陈峥;[N];中国医药报;2004年

2 梁薇;[N];中国医药报;2005年

3 记者 刘海英;[N];科技日报;2013年

中国博士学位论文全文数据库 前7条

1 许文平;去甲泽拉木醛的免疫抑制作用及药代动力学研究[D];复旦大学;2012年

2 李秀英;人间充质干细胞生物学特性及免疫抑制作用机制的研究[D];吉林大学;2015年

3 冯璞;雷公藤多甙与TGP的协同免疫抑制作用及其对实验性变态反应性脑脊髓炎的防治作用研究[D];中国协和医科大学;1998年

4 刘欣燕;青蒿琥酯、氧化苦参碱对L929肿瘤细胞免疫抑制作用影响及相关分子机制研究[D];河北医科大学;2008年

5 林新;1. A链链内二硫键错接（A11Ser，A12Cys）胰岛素突变体的构建、表达及其活性分析 2. 淫羊藿化合物抗肿瘤活性筛选和小檗胺免疫抑制作用的研究[D];中国协和医科大学;1998年

6 伦玉宁;四氢嘧啶类化合物ZL-5015的免疫抑制作用及其作用机制研究[D];南方医科大学;2013年

7 王娜;肝再生增强因子免疫抑制作用与调节性T细胞的关系及相关机制研究[D];重庆医科大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 韩艳鑫;骨髓增生异常综合征患者骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用[D];山东大学;2012年

2 魏晓平;天然药物XGD-1免疫抑制作用的实验研究[D];昆明医学院;2003年

3 亓俊华;TNF-α增强小鼠骨髓间充质干细胞免疫抑制作用的探讨[D];青岛大学;2014年

4 莫正魁;青蒿素对小鼠迟发型超敏反应的免疫抑制作用[D];昆明医学院;2004年

5 曹宁;南山藤活性成份的免疫抑制作用研究[D];南京大学;2012年

6 周炳娟;维生素C预处理对脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导的免疫抑制作用影响的实验研究[D];河北医科大学;2006年

  本文关键词：人间充质干细胞生物学特性及免疫抑制作用机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：217509