新型磁性纳米复合物的制备及其在普鲁兰酶固定化方面的应用研究

发布时间：2018-10-14 11:40

【摘要】：普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)属淀粉脱支酶,为淀粉加工业中的非大宗关键酶制剂,目前具有工业属性的普鲁兰酶非常有限,价格昂贵,且存在热稳定性及pH耐受性差等缺陷,提高普鲁兰酶的回收利用率及稳定性是该酶研究的重点和热点问题。论文拟采用固定化技术改善普鲁兰酶的酶学特性,实现其重复利用。磁性纳米材料用于固定化酶具有诸多优势,如较大的比表面积、较小的传质阻力、超顺磁性及良好的生物相容性等。因此,本课题从静电吸附、共价交联、化学结合包埋等方法出发,采用有机凝胶诱导及原位共沉淀等方法制备新型的磁性纳米复合物应用于普鲁兰酶的固定,得到催化效率高、稳定性好、易于分离的固定化酶,并将其成功应用于抗性淀粉的制备中。首先,采用原位共沉淀法制备磁性卡拉胶纳米复合物,通过静电吸附壳聚糖-普鲁兰酶复合物得到固定化酶。采用TEM、XRD、FTIR、VSM及TGA等手段对固定化酶进行表征,结果表明固定化酶的平均粒径为152 nm,具有Fe3O4尖晶石结构;卡拉胶硫酸基团电荷被中和后固定化酶磁响应性提高到42.6 emu/g。在最佳固定条件下,所得到的固定化酶的酶活保留率达到95.6%,酶固载量为96.4 mg/g;重复使用10次后仍能保留原始酶活的61%,显著的改善了催化反应过程中酶泄漏现象。研究了静电吸附固定过程中壳聚糖分子量对普鲁兰酶-壳聚糖可溶性复合物的形成以及固定效果的影响。通过浊度滴定法研究普鲁兰酶与壳聚糖的复合行为,结果表明pHφ1、pHmax的出现及偏移均受壳聚糖分子量的影响,其中,普鲁兰酶-壳聚糖-50的pHφ1偏移到更低pH值以达到电中和。复合物表面电荷随着壳聚糖分子量的增大而增多,平均粒度逐渐降低。采用荧光光谱研究壳聚糖对普鲁兰酶的荧光淬灭作用,结果表明壳聚糖与普鲁兰酶的结合常数(Ksv)按CS-500CS-400CS-50CS-200顺序增大。通过对酶二级结构变化的研究表明壳聚糖-200-普鲁兰酶复合物中酶的二级结构变化较大,α-helix从31%降低到19%,影响到固定化酶的最终酶活:当壳聚糖分子量为200 kDa时,酶活保留率较低(46.1%),且操作稳定性较差,而当壳聚糖分子量为50 kDa时,固定化酶酶活保留率达到最大值(96.3%),并且展示了较好的热稳定性及重复使用性。其次,采用壳聚糖水凝胶诱导法原位制备Fe3O4-壳聚糖纳米粒子并共价固定普鲁兰酶。采用TEM、FT-IR、XRD及TGA等手段表征Fe3O4-壳聚糖纳米粒子,结果表明有机诱导合成Fe3O4-壳聚糖纳米粒子过程中螯合作用限制了铁离子扩散和晶体生长,所得到的纳米颗粒平均粒径为5 nm,饱和磁强度为60.8 emu/g,壳聚糖及Fe3O4的含量分别为12.7%和83.28%。通过研究共价固定过程中酶初始浓度及pH值的影响发现,最佳的固定条件为:酶浓度60μg/m L,pH值4.4;酶固定后热稳定性和操作稳定性相较于自由酶大幅提高,其最适pH值往酸性方向偏移(pH 3.5)。基于共价交联固定,探讨了不同的共价固定方式(EDC或GA交联、NaBH4还原)、共价固定密度及交联剂臂长对固定化效果的影响。研究表明,GA为交联剂时固定化酶酶活保留率高于EDC为交联剂得到的固定化酶;由于GA活化的载体用于固定化酶时基于与酶赖氨酸氨基的反应,因此进一步用NaBH4还原席夫碱为更稳定的仲氨键得到了操作稳定性较高的固定化酶,然而,还原作用有可能还原酶的部分二硫键,使得固定化酶的活性降低;当载体表面氨基浓度为1.6 per nm2时,固定化酶的酶活保留率达到最大值(75%),此时,酶与载体间形成大约57.6 per 3600??2共价键;GA活化时较长的手臂(15%,二聚体)相比较短的手臂(0.5%,单体)拥有更高的酶活保留率(85%)。然后,基于Fe3O4-壳聚糖纳米粒子,在共价固定的基础上,采用sol-gel法设计合成了磁性壳聚糖纳米颗粒为内核、聚合物为外壳的包埋固定化普鲁兰酶。采用SEM、VSM、FTIR及TGA等手段对固定化酶进行表征,结果表明在sol-gel反应过程中,添加酶后所得到的凝胶颗粒形貌更规整,磁响应性也提高到26.8 emu/g,普鲁兰酶的含量约为8.83%。包埋固定的最佳条件为:硅烷前体的种类及比例为OTES/TEOS=1/2,酶浓度0.484mg/m L sol。比较共价结合与非共价结合包埋酶的酶学性质差异,结果表明共价结合包埋所得到的固定化酶的稳定性和重复使用性显著高于单一包埋所得到的固定化酶,酶泄露现象得到改善;从稳定性及酶活保留率两方面综合考虑,将酶首先通过碳二亚胺活化与磁性载体交联后再sol-gel包埋得到的固定化酶的效果较好,其酶活保留率为81.3%,重复使用6次后相对酶活仍为原始酶活的87%。最后,将上述三种固定方法制备得到的固定化酶用于抗性淀粉的制备,研究结果表明,采用压热联合自由酶水解得到的抗性淀粉含量(35.1%)高于仅采用压热处理(12.5%),而采用压热联合固定化酶水解得到的抗性淀粉含量高于自由酶处理,其中包埋固定化酶处理最高,达到43.3%。采用HPSEC测定酶水解后淀粉分子量变化,结果表明,与自由酶相比,共价及包埋固定化酶处理的淀粉样品出现Peak C特征峰(对应于分子量6200),倾向于产生更多的低分子量线性短侧链。通过DSC测定不同淀粉样品的糊化温度,结果表明酶脱支处理后淀粉的峰值温度都往更高的方向偏移(130℃左右)。重复使用性结果表明,静电吸附、共价交联以及共价结合包埋得到的固定化酶在重复水解淀粉样品8次后,其抗性淀粉得率分别为原始的61.3%、70.4%及75.7%。综合抗性淀粉得率及酶的重复使用性考虑,共价结合包埋得到的固定化酶在抗性淀粉制备方面相较于其它两种固定方法效果更好。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q814.2;TB33

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