基于比较转录组的棕色田鼠与布氏田鼠低氧适应研究

发布时间：2018-10-16 13:31

【摘要】：氧是地球上大多数生物赖以生存的必需元素,低氧(Hypoxia)环境会造成生物体内部组织或细胞缺氧,继而引起机体的应激反应,产生生理病理变化并影响生长发育过程。地下鼠长期生活于氧气含量较低的地下洞道系统中,在形态、生理、行为和遗传等方面形成了良好的低氧适应。棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)终生营地下生活,是一种典型的地下鼠,其近缘种布氏田鼠(L.brandtii)则以地面活动为主,二者是地下低氧环境适应比较研究的理想对象。本论文以棕色田鼠为研究对象,以布氏田鼠为对照;通过对棕色田鼠野外环境参数的调查,获得了不同季节洞道系统中O2/CO2含量、温度、湿度等数据;通过构建基于线粒体基因组序列的进化树,确定了棕色田鼠和布氏田鼠的分类地位与亲缘关系;在低氧舱内模拟慢性低氧和急性低氧状态,完成不同氧环境下棕色田鼠和布氏田鼠脑组织转录组的测序、de novo组装和注释;采用比较转录组方法,分析不同低氧处理对棕色田鼠和布氏田鼠脑组织转录组基因表达的影响;结合棕色田鼠的全基因组测序、de novo组装和注释结果,对棕色田鼠有参和无参转录组差异表达结果的一致性进行了研究;最后,系统整理了棕色田鼠和布氏田鼠低氧转录组数据以及棕色田鼠全基因组数据,构建具有存储、管理、查询和局域网远程访问功能的数据库,实现数据的共享和可视化操作。主要结果分述如下:1)棕色田鼠洞道长约40 m,分支较少,取食与活动洞道深度为20~30 cm,主巢和粮仓深度为60~80 cm。洞道内温度恒定为24±2℃、湿度保持90%以上;正常洞道内氧气含量为17.24%~19.48%,雨后最低达到16.04%;洞道内CO2含量在0.03%~2.55%之间,与氧气浓度呈显著负相关(r=-0.85,p0.001)。2)基于线粒体基因组序列系统进化分析结果表明,棕色田鼠与布氏田鼠同隶属于毛足田鼠属(Lasiopodomys),该属独立成枝,与田鼠属(Microtus)分枝有明显区分,与狭颅田鼠(Microtus gregalis)和凉山田鼠(Proedromys liangshanensis)共同构成单独进化枝。3)通过高通量测序,获得棕色田鼠和布氏田鼠的18个脑组织样品的135Gbp高质量转录组数据;使用合并组装法分别获得了两种鼠转录本的unigene集,N50长度均大于2,200 bp,组装效果较好;转录本注释后分别得到棕色田鼠的20,172和布氏田鼠的19,215个注释结果,其中,棕色田鼠Nr注释结果中有2%的基因与同为地下鼠的盲鼹形鼠(Spalas galili)相似性较高。4)与常氧处理相比,10%慢性低氧处理48 h后,棕色田鼠有695个基因表现出差异表达,布氏田鼠则仅为158个;进一步采用差异表达基因的功能注释、代谢通路富集及蛋白互作网络分析等方法研究,结果显示,棕色田鼠上调了氧气运输、血管生成、抑制血管生成、DNA修复、细胞凋亡、细胞自噬等功能的调控基因,脑神经保护和修复、CO2防护、血压和神经兴奋性升高等功能也有相应上调,此外,下调了蛋白水解、辅酶代谢等耗氧功能调控基因;布氏田鼠氧气运输、血管生成和抑制、脑神经保护和修复及CO2防护等功能的调节基因有所上调,神经递质多巴胺合成及传递相关的多个基因表达下调。比较两物种慢性低氧应答发现,布氏田鼠细胞水平的应答较少,暗示棕色田鼠对慢性低氧的敏感性和应答强度均较高。5)与常氧处理相比,5%急性低氧处理6 h后,棕色田鼠有1,386个基因表现出差异表达,布氏田鼠则高达1,878个;进一步分析发现,二者差异基因的功能注释、代谢通路富集结果较为接近,均在血管生成、无氧呼吸激活、DNA修复和细胞增殖与凋亡等方面有大量功能基因表达上调。不同的是,棕色田鼠急性低氧下神经细胞生成与保护和多个抑制血管生成相关基因上调、多巴胺合成与运输相关基因下调,且有多个癌症相关基因和抑癌基因表现出与肿瘤微环境相反的表达模式;布氏田鼠的主要上调功能集中于血管生成和免疫应答,调控功能较为单一,神经细胞生成与保护相关基因出现下调表达,暗示棕色田鼠的急性低氧应答策略可能更为高效。6)棕色田鼠全基因组测序获得140X基因组覆盖度的高质量数据,组装后得到总长为2.10Gbp的Contigs,N50为51.15kbp,补洞后得到代表基因组全长的Scaffolds共2.15Gbp,N50达到6.15Mbp;reads回比分析获得777万余个SNP位点;同源比对和从头预测共获得33.93%的重复序列、21,229个编码基因和7,000余个非编码RNA序列,共有19,801个编码基因得到注释;基于棕色田鼠全基因组的有参/无参转录组结果呈极显著的正相关关系(r=0.836,p0.0001)。7)使用Access软件将棕色田鼠和布氏田鼠的转录本拼接和注释结果归类整理为本地化数据库;通过BLAST+和Sequenceserver构建两个转录组和棕色田鼠全基因组的本地BLAST比对数据库;最后使用过Java语言和Apache+Tomcat服务器实现数据库信息的局域网远程访问。结论:1)棕色田鼠洞道系统温度稳定,湿度较高,氧气含量较低,二氧化碳含量较高,与Spalax属物种的野外洞道环境参数相似;2)棕色田鼠与布氏田鼠均隶属于毛足田鼠属,与田鼠属分枝区分明显,与狭颅田鼠和凉山田鼠共同构成单独进化枝;3)棕色田鼠和布氏田鼠的转录本unigene集各参数均比较相似,可能与二者亲缘关系接近有关;棕色田鼠Nr注释结果中有2%与盲鼹形鼠相似性较高,推测与地下低氧环境适应产生的趋同进化有关;4)与布氏田鼠相比,棕色田鼠对急性和慢性低氧均具有较强的适应能力,分子机制主要包括高效的能量利用、严格的血管生成调控以及多层面的细胞修复与凋亡调节;5)布氏田鼠具有一定的低氧适应能力,主要表现在低氧时血管生成调控及氧气运输能力的提升,但能量代谢和细胞增殖/凋亡水平的调控少于棕色田鼠,与地面动物常见的低氧应答机制类似;6)棕色田鼠全基因组测序得到高质量的组装和注释结果,有参转录组分析与无参转录组分析结果拥有较高的一致性;7)构建的棕色田鼠转录组和棕色田鼠基因组数据库实现了数据的局域网访问及可视化查询。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q953

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