白桦成花调控因子BpFLC及BpSVP协同调控晚花的作用机理研究

发布时间：2018-10-21 14:00

【摘要】：开花是植物由营养生长向生殖生长转变的开关,是植物生命周期重要组成部分。植物成花调控研究主要集中在一年生模式植物拟南芥中,多年生植物成花诱导是更为复杂的遗传调控过程,其调控开花的分子机制仍不清楚。鉴于草本植物与木本植物在发育过程中存在巨大差异,延长林木童期使其延缓进入生殖期对林木资源开发与利用具有重要意义。为了探究白桦晚花调控机理,利用分子生物学技术对两个白桦成花调控抑制因子BpFLC和BpSVP基因的表达模式与功能进行初步研究。主要结果如下：(1)白桦不同组织定量PCR检测结果表明BpFLC基因在各个组织中均有表达,且在茎尖和幼叶中表达量最高。经春化处理幼叶中BpFLC基因表达量显著下调。克隆BpFLC基因上游2000 bp启动子在植物表达载体中驱动GUS基因表达并对拟南芥进行遗传转化。GUS染色结果表明GUS主要在生长点、幼叶、成熟花序中着色较深,几乎所有组织中均有BpFLC基因表达。BpFLC启动子并不是春化应答主要部位,大量证据表明FLC基因第一内含子是响应春化作用关键部位。(2)拟南芥flc突变体具有早花形态学特征,异源表达BpFLC基因能恢复flc突变体表型,回补植株呈现出正常开花或晚花表型。BpFLC基因异源表达在野生型拟南芥中能显著延迟开花,并且转基因植株能形成更多莲座叶,更大的生殖器官并能延长生命周期。异源表达BpFLC基因不能响应春化作用。(3)利用RNA-Seq技术对野生型和过表达BpFLC植株进行测序分析,no-flowering组中有237个差异表达基因,其中51个基因上调表达,186个基因下调表达；flowering组中有852个差异表达基因,其中271个基因上调表达,581个基因下调表达,两组重叠基因为140个。GO富集显示差异基因主要分布在生物过程调控、发育进程、生殖过程、细胞成分的生物合成等功能组中,且存在大量与生殖发育相关基因,如花粉外壁形成、花粉细胞壁组装、授粉作用、有性繁殖、生殖细胞进程、花粉管发育和花粉管生长。(4)从白桦幼叶中克隆出晚花调控基因BpSVP,其开放阅读框(ORF)长度为678 bp,共编码氨基酸225个,其属于MIKC型MADS蛋白家族,蛋白质相对分子量为25.25KD,理论等电点为6.68,同源性分析显示与山核桃的同源性最高(92%)。(5)白桦不同组织定量PCR检测结果表明BpSVP基因仅在营养器官中表达,且在幼龄植株内的表达量要高于成龄植株,同时幼叶中的表达量也高于成熟叶和茎尖。BpSVP基因响应光周期调控而不应答春化调控。构建BpSVP-GFP融合载体pUC-35S::BpSVP-GFP,并瞬时轰击洋葱表皮细胞的亚细胞定位表明,BpSVP是一个核定位蛋白。克隆BpSVP基因上游启动子构建植物表达载体pBI121-BpSVPpro,驱动GUS基因表达并对拟南芥进行遗传转化。GUS染色结果表明GUS主要在根、幼苗、莲座叶及萼片中均有着色,推测BpSVP基因在植物生长和发育的各个时期均有表达。(6)构建植物表达载体pROKII-BpSVP并转化拟南芥,BpSVP在转基因植株的基因组与转录组水平中均能检测到。与野生型相比,转基因植株表现出晚花表型,约推迟开花20天,同时转基因株系存在畸形花。定量PCR检测结果表明,转基因植株中内源AtFLC表达水平显著上调,AtSOC1、AtFD、AtFT、AtLFY、AtAP1等成花基因的表达水平显著下调,而AtSVP与AtAGL24表达水平变化不显著。(7)酵母双杂交验证结果显示BpFLC能与BpSVP发生蛋白互作,进一步验证显示BpFLC与BpSVP也分别能与自身及自身截短体发生同源相互作用。BpFLC与BpSVP截短体之间的异源互作验证证明,BpFLC3和BpSVP3中的K结构域是BpFLC与BpSVP发生同源或异源互作的基础。最后,酵母双杂交显示BpFLC也能与AtFLC及AtSVP发生蛋白互作。综上所述,本研究将为多年生林木调控开花提供理论基础和实验依据,为林木遗传改良提供理论依据和相关基因。
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【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.153;Q943.2
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本文编号：2285293