嗜热链球菌染料过氧化物酶及其转运系统研究

发布时间：2018-10-23 10:23

【摘要】：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是重要的工业菌株,作为发酵剂与保加利亚乳杆菌或瑞士乳杆菌一起应用于酸奶或奶酪的生产,赋予产品特殊的风味、质地和保质期。发酵剂菌株的活力直接影响发酵乳的品质,但是容易受到酸、温度、氧、渗透压等因素的影响。因此,阐明菌株抗性机制,提高其抗胁迫能力,是制备高活性发酵剂的关键。嗜热链球菌属于兼性厌氧菌,在所有胁迫中,氧胁迫对其造成的伤害最为严重。研究发现嗜热链球菌具有一定的抵抗活性氧的能力,可以在有氧条件下生长和在低H2O2浓度下存活,但是该菌株缺少过氧化氢酶,其抵抗过氧化氢胁迫的机制一直未被阐明。本文主要围绕S. thermophilus CGMCC7.179过氧化物酶的鉴定和作用展开研究。首先对已测序的S. thermophilus CGMCC7.179进行基因组序列分析,鉴定出了染料过氧化物酶及其相关基因,并检测了这些基因是否具有抵抗氧胁迫的能力,进一步研究了染料过氧化物酶消除过氧化氢的能力和作用方式；研究了染料过氧化物酶转运系统的功能,并探讨了该系统在其它乳酸菌中的可利用性。取得的具体实验结果如下：1. S. thermophilus CGMCC7.179染料过氧化物酶efeB基因的遗传组成和抗氧胁迫能力嗜热链球菌具有超氧化物歧化酶,其催化产生的H2O2会对细胞造成伤害。然而,嗜热链球菌中H2O2的消除机制尚不清晰。本文在S. thermophilus CGMCC7.179的基因组中发现了一个染料过氧化物酶家族的基因efeB,其编码蛋白的氨基端携带一个具有双精氨酸易位(twin-arginine translocation, Tat)保守基序的信号肽,而且此基因与Tat系统的结构元件基因tatA和tatC一起位于efeOBU-tatCA操纵子中。敲除fefB基因不影响S. thermophilus CGMCC7.179在静置条件下的生长,但是会导致S.thermophilus CGMCC7.179在摇动培养时的生物量和活菌数显著下降,说明EfeB具有抵抗氧胁迫的能力。tatC基因的敲除对S. thermophilus CGMCC7.179的影响类似于efeB基因,而且,只有在tatC基因存在时,回补efeB基因才能够弥补S. thermophilusCGMCC7.179 efe B缺失株在摇动培养时的生物量下降。说明EfeB抗氧胁迫能力的实现需要Tat系统的协助。同时,S. thermophilus CGMCC7.179中的氯霉素抗性实验和Escherichia coli DE3中的亚细胞定位实验进一步证实了TatCA对EfeB的转运功能。此外,RT-PCR实验证实,在摇动培养条件下,efeB和tatC基因的转录水平均得到了相似的上调,进一步表明这两个基因属于一个操纵子。以上结果表明S. thermophilus CGMCC7.179编码的EfeB经Tat系统转运至胞外,以缓解细胞受到的氧化压力的伤害。2.5. thermophilus CGMCC7.179 EfeB的功能研究血红素过氧化物酶可以催化特定的电子供体还原过氧化氢为水,根据其作用和结构特征,血红素过氧化物酶可以分为动物过氧化物酶、植物过氧化物酶家族和新划分出的染料过氧化物酶家族。本文为了确定EfeB的功能,首先将其序列与多种染料过氧化物酶的序列进行了比对,发现EfeB具有染料过氧化物酶的保守结构域G-X-X-D-G和heme结合位点,并且与肉葡萄球菌编码的染料过氧化物酶FepB的相似性高达48.13%,表明EfeB具有染料过氧化物酶的结构特征。为了研究EfeB的酶学性质,我们在大肠杆菌中表达纯化了EfeB蛋白,该蛋白在200μM H2O2条件下可以使活性蓝5褪色,表明EfeB具有过氧化物酶酶活,此反应的最适pH和最适温度分别为4.0和30℃,与嗜热链球菌的生长环境并不相符。为了检测EfeB消除H202的能力,我们测定了S. thermophilus CGMCC7.179及其efeB缺失株的摇动培养物中的H202浓度,结果显示fefB缺失会导致培养环境中H202浓度的升高,表明EfeB具有消除生存环境中H2O2的能力。此外,实验发现S. thermophilus CGMCC7.179的efeB缺失株能够利用三价铁离子,但是缺少利用二价铁离子的能力,而且对高浓度二价铁离子的耐受能力降低,表明EfeB可以氧化二价铁离子。由此可见,S. thermophilus CGMCC7.179中的EfeB具有消除H2O2的作用,同时与二价铁离子的摄取有关,与efeOBU的基因结构相吻合。3. S. thermophilus CGMCC7.179 Tat系统组分的功能研究Tat系统负责转运折叠后的蛋白,在转运含辅基或多亚基蛋白方面具有优势,但是这一系统在乳酸菌中非常罕见。我们在S. thermophilus CGMCC7.179中发现了Tat系统的TatA和TatC组分,但是它们的功能鲜为人知。本文中我们将tatA基因和tatC基因回补到E. coli DE3的tat缺失菌株中,构建了回补菌株E. coli ArA, ArAB, CrC和 ACrAD用以检测TatA和TatC组分的功能。E.coli DE3的tat缺失菌株对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感,而且细胞表现为链状。在回补菌株中,E coli ArAB和CrC既表现出相对正常的细胞形态,也能够抵抗较高浓度的SDS。然而,E. coli ACrAD只有相对正常的细胞形态,对SDS仍然极为敏感。与之相反,E. coli ArA能够耐受SDS,却表现出极为严重的细胞链化现象。这些结果表明,TatA和TatC在E. coli DE3的tat缺失菌株中都具有易位酶活性,可以帮助E coli DE3缺失株缓解细胞链化或者重建SDS抗性。而且TatA是一个双功能组分,可以同时弥补TatAE和TatBE(下标“E”表示此组分属于大肠杆菌)；另一方面,TatA的作用效果会受到TatBE的影响。因此,S.. thermophilus CGMCC 7.179的TatA和TatC都具有Tat组分的典型功能,它们可以在大肠杆菌中组成一个最小化的Tat系统。根据上述实验结果,可以推测出S.. thermophilus CGMCC7.179 efeOBU-tatCA操纵子的作用方式。TatC和TatA形成通道,将EfeB转运至胞外；EfeB在胞外具有双功能,一方面可以以蒽醌类物质为电子供体消除环境中的过氧化氢,另一方面将二价铁离子氧化为三价铁离子,再由EfeOU复合体摄取到胞内。4. S. thermophilus CGMCC7.179 Tat系统在乳酸乳球菌中的利用乳酸菌作为食品级安全菌株,是优秀的食品级重组蛋白生产菌株。为了提高重组蛋白的产量,研究者们正不断丰富其表达和分泌系统。目前乳酸菌中使用的分泌系统以Sec系统为主,大多数乳酸菌不具有可以分泌折叠蛋白的Tat系统。本文从蛋白功能和蛋白亚细胞定位两个方面探究S. thermophilus CGMCC7.179的Tat系统在Lactococcus lactis MG1363中的功能。由于Lc.lactis MG1363的抗氧化能力强于S.thermophilus CGMCC7.179,不受摇动培养的影响,我们使用H2O2来检测菌株的抗氧化能力。弱启动子驱动下低量串联表达的EfeB和TatCA不能提高Lc. lactis MG1363的抗H202能力；强启动子驱动下高量串联表达EfeB和TatCA可以解除单独高量表达EfeB造成的生长速度减缓,而且增强了Lc. lactis MG1363的抗H202能力,表明TatCA可以转运EfeB,并发挥抗氧胁迫能力。为了直观展示Lc. lactis MG1363中TatCA对底物蛋白的转运,我们分别将金黄色葡萄球菌核酸酶基因nuc和绿色荧光蛋白基因gfp与EfeB的信号肽序列sp融合后作为报告基因,与tatCA一起转化到Lc. lactis MG1363中。结果表明,TatCA可以转运spNuc蛋白至胞外,但是转运spGFP的能力非常有限。所有结果表明,S. thermophilus CGMCC7.179的Tat系统在Lc.lactis MG1363中可以发挥作用,但是对于不同的底物蛋白有不同的效果。5. Lactobacillus fermentum 1001木糖利用脱阻遏机制研究发酵乳杆菌是一种生存环境较为复杂的乳酸菌,可以同时利用葡萄糖和木糖,缺失碳源代谢物抑制(CCR)。为了研究这一现象的原因,本文首先验证了Lact.fermentum 1001 CcpAf的生理功能。RT-PCR结果表明Lact.fermentum 1001中ccpAf基因的可以正常转录；Lc.lactis MG1363 ccpA缺失菌株的生长会明显滞后于野生菌株,回补ccpAf基因可以有效提高Lc. lacrtis MG1363 ccpA缺失菌株的生长速度,此结果证明CcpAf具有正常的生理功能。为了探究是否是1,6-二磷酸果糖的缺失造成了Lact.fermentum 1001中CCR的缺失,我们在Lact. fermentum 1001中表达了Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842的磷酸果糖激酶,重组菌的果糖的利用会受到葡萄糖的松散抑制,但是木糖的利用不受影响,表明CcpAf在 Lact. fermentum 1001中可以正常发挥作用,1,6-二磷酸果糖的缺失是Lact. fermentum 1001中CCR缺失的一个原因。此外,Lact. fermentum 1001木糖操纵启动子(Plx)的活性在具有CCR的Lact.casei BL23中也未受到葡萄糖的抑制,而果糖操纵子的活性受到了松散抑制,表明启动子区域代谢物响应元件(cre)的缺失也会影响CCR。总之,Lact. fermentum1001的木糖利用脱阻遏是由缺少cre和磷酸果糖激酶造成的。Lact. fermentum 1001缺少CCR,可以同时利用多种碳源以生产高附加值产品的。用Plx对乳酸菌进行代谢工程改造,可以提高它们利用复杂碳源时的发酵效率。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936
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本文编号：2288953