拟南芥核苷三磷酸水解酶APP1通过影响ROS的稳态参与根尖干细胞微环境的维持

发布时间：2018-10-24 16:12

【摘要】：植物根尖干细胞微环境对于植物根的生长发育具有重要作用,其中根尖干细胞是产生根中不同组织细胞的源泉,而位于干细胞中间的静止中心(Quiescent Center, QC)细胞对于干细胞活性的维持具有十分重要的调控作用。目前研究发现的参与根尖干细胞微环境维持的调控途径主要包括SCR/SHR调控途径、PLT调控途径、WOX5调控途径、各种激素(生长素、细胞分裂素、乙烯、脱落酸以及赤霉素等)参与的调控途径。然而,参与根尖干细胞微环境维持的其它调控因子目前仍不清楚。因此,我们的研究致力于发现新的参与维持根尖干细胞微环境的调控元件,这对于进一步阐明根尖干细胞微环境维持的调控机制网络具有十分深远的意义。本研究以模式植物拟南芥为研究对象,通过Lugol染色,从T-DNA插入突变体库中特异的筛选具有根尖干细胞发育缺陷表型的突变体材料,进行后续研究。在此,通过筛选我们获得了一个新的参与根尖干细胞微环境维持的功能基因APP1 (A-P-loop NTPase superfamily Protein)。采用分子生物学、细胞生物学、遗传学及生理学等技术方法,对APP1参与调控根尖干细胞微环境维持的分子机制进行了深入的研究分析。Lugol染色的结果发现,app1功能缺失突变体根尖QC细胞发生了明显的纵向分裂,并且远端干细胞(Distal stem cell, DSC)处出现了明显的能够被KI染色的淀粉粒积累,表明失去了干细胞活性。此外,QC特异标记基因QC184在app1突变体中的表达量明显低于野生型,这表明app1突变体中QC的特性受到了破坏。为了阐明其作用机理,我们进一步检测APP1表达模式及其编码蛋白的亚细胞定位。对pAPP1::GUS转基因系的GUS染色结果表明,APP1主要在拟南芥的根中表达,而且主要集中在根尖处；此外,激光共聚焦观察pAPP1:.APP1-GFP转基因株系的结果发现,APP1蛋白也是主要在根尖处表达,暗示APP1可能参与根尖生长发育的调控。激光共聚焦观察结果显示,pAPP1::APP1-GFP绿色荧光蛋白和红色荧光MT-Red标记的线粒体能够重叠,说明APP1蛋白定位于线粒体;另一方面,western blot结果显示,在pAPPl::APP1-GFP转基因植株的线粒体蛋白中能够同时检测到APP1蛋白和线粒体特异标记COX IV蛋白,进一步说明APP1蛋白定位于线粒体。这也暗示APP1可能通过影响线粒体的功能参与根尖干细胞微环境的维持。体外ATP酶活测定结果说明,APP1具有ATP水解酶活性。为了阐明线粒体定位且具有ATP水解酶活性的APP1是否影响ROS稳态的维持。我们通过荧光染料H2DCFDA和化学染料DAB以及NBT检测app1突变体中ROS的水平。结果显示,在app1中的荧光强度或化学染色水平要明显低于野生型,表明app1中的ROS水平显著降低;此外,与野生型相比,app1突变体中线粒体O2-的标记rnarker Mito-cpYFP也明显低于野生型对照。并且H202含量的测定结果显示app1-1和app1-2突变体中H202的含量明显低于Col-0对照。这些结果说明APP1能影响根尖ROS的含量,包括H202含量和O2-含量。进一步分析APP1影响根尖ROS水平的机制,我们发现在app1突变体中第1II类过氧化物酶(Peroxidases, PER)家族中的PER11和PER55基因的表达受到明显诱导,说明app1突变体中较低的ROS水平可能与高表达的过氧化物酶PER11和PER55参与ROS的清除有关。此外,app1突变体中线粒体复合体I的活性,即NADH-CoQ还原酶的活性与野生型相比明显降低,这与app1突变体中ROS水平低是相一致的。为了进一步验证app1突变体中QC细胞分裂和DSC分化的加快是否是由于app1突变体中较低的ROS水平引起的,我们对app1突变体进行外源施加H202及02-的供体。结果显示,无论是通过MV处理升高02-的水平,还是通过直接外源施加H2O2,都能够恢复app1突变体中QC细胞分裂和DSC分化加快的表型。此外,通过外源施加ROS的合成抑制剂DPI和清除剂catalase降低ROS的水平,则能够模拟app1突变体中的低ROS水平导致的QC细胞分裂和DSC分化的表型,破坏根尖干细胞微环境功能的维持。为了深入了解ROS稳态是如何影响根尖干细胞微环境的,我们对高ROS水平下QC细胞和根尖DSC细胞的表型进行了研究。我们发现高浓度的H202也会促进QC细胞的分裂以及DSC的分化；此外,APP1的超表达转基因株系35S：.APP1中ROS含量明显升高,并且表现出较高的QC分化率和DSC分化率的表型。以上结果说明,无论是内源升高ROS水平还是外源升高ROS水平都会加速QC细胞的分裂和DSC的分化,对根尖干细胞功能造成一定程度的破坏。GRAS转录因子家族的SCR(SCARECROW)和 SHR(SHORTROOT)以及PLETHORA转录因子家族的PLT1和PLT2对于维持QC细胞的功能、干细胞的稳定具有重要的调控作用。为了研究APP1参与调控根尖干细胞的机制,我们对app1中SCR、SHR、PLT1以及PLT2的表达量进行了检测。qRT-PCR、细胞生物学以及western blot的结果均显示app1变变体根尖中SCR和SHR在转录水平和蛋白水平的表达量都明显降低,而PLT1和PLT2的表达量无明显变化,暗示SCR和SHR可能作为APP1的下游基因共同参与APP1对于根尖干细胞微环境维持的调控。已有的研究表明,生长素参与根尖干细胞微环境的维持。我们发现DR5rev::GFP和DR5::GUS在app1-1和app1-2突变体中的表达量与野生型Col-0中相比无明显变化,说明app1突变体中生长素信号没有发生明显改变,暗示APP1对于根尖干细胞微环境的调控机制可能是独立于生长素调控途径的。进一步研究ROS稳态参与根尖干细胞微环境维持的分子机制,我们分析了不同ROS浓度下调控干细胞功能的转录因子SCR、SHR、PLT1以及PLT2表达量的变化。结果显示,在高ROS浓度时,PLT1和PLT2的表达量受到明显下调,而SCR和SHR的表达量没有明显变化；而在低ROS浓度时,SCR和SHR的表达量明显降低,PLT1和PLT2的表达量无显著变化,这与app1突变体中转录因子的表达情况是相一致的。这暗示高ROS水平和低ROS水平对于根尖干细胞微环境的调控可能是通过调控不同转录因子的表达,通过不同的信号通路实现的。综上所述,我们的研究发现APP1主要是通过影响根中ROS稳态的维持,从而下调SCR和SHR的表达,参与根尖干细胞微环境的维持。此外,我们还发现植物体内存在一个最适的ROS浓度,维持根尖干细胞的正常功能,过高的ROS水平或过低的低ROS水平都可能导致根尖干细胞微环境的破坏。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q945

【参考文献】