鸭肫抗氧化肽特性及作用机理研究

发布时间：2018-10-26 09:58

【摘要】：生物活性肽可作为高效、安全的生物制品,具有重要的研究价值和应用前景。鸭肫属优质蛋白资源,高值化开发利用是产业发展的方向。本论文以鸭肫蛋白为原料,通过可控酶解技术制备抗氧化肽;利用超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对产物进行逐级分离纯化,采用质谱技术对目标肽段进行一级氨基酸序列的鉴定;建立分子结构模型并验证抗氧化肽的定量构效关系;通过作用于细胞,分析细胞生长抑制、凋亡、生长周期以及细胞内抗氧化酶活性及酶蛋白表达,从分子机制进一步阐明鸭肫肽的抗氧化机理。本文旨为鸭肫蛋白的深度开发和应用,提升其资源高值化利用提供理论依据和技术支撑。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)分析了木瓜蛋白酶酶解液中氨基酸含量,其总氨基酸含量高达33594.73 mg/100 g,主要抗氧化性氨基酸含量达9.54%。在单因素实验基础上,以水解度和DPPH清除率为响应值,确定鸭肫蛋白酶解的最佳工艺条件为:酶解时间4.0 h、加酶量3000 U/g、酶解温度55℃、料液比1:3。在此条件下其水解度为28.30%,DPPH清除率为75.22%。其水解度与DPPH自由基清除能力之间不存在明显的相关性。(2)探讨了鸭肫不同分子量段ZT1(3 kDa)、ZT2(3-10 kDa)和ZT3(10kDa)产物抗氧化活性。其自由基DPPH清除率和ORAC活性值与其分子量呈显著相关性,分子量小于3kD产物DPPH清除率77.59%,ORAC活性值885.25μmol TE/g。小于3kD鸭肫抗氧化肽清除超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢以及DNA损伤的保护作用具明显的量效关系,其IC50值分别为14.58、0.0163、19.80和1.93mg/mL,鸭肫抗氧化肽对过氧化氢自由基抑制作用最强,对羟自由基活性的抑制作用最弱。(3)分离及鉴定鸭肫抗氧化活性肽。采用中空纤维素膜超滤法对酶解液进行初步分离,将ORAC值活性最高的组分(小于3kDa)使用凝胶色谱和半制备RP-HPLC进一步分离,将纯化的ORAC值活性较高的组分进行氨基酸序列分析鉴定,确定了两个新型的鸭肫抗氧化活性肽,分别为Ser-Ser-Tyr-Glu-Gly-Ile-Glu-Leu-Ile-Ile-Lys和Asn-Lys-Phe-Ile-Leu-Lys。(4)采用ACD/Labs软件对部分已知抗氧化肽化学结构信息进行描述,利用多元线性回归(MLR)、偏最小二乘回归(PLS)和人工神经网络(BPNN)分析方法建模,对抗氧化肽进行活性预测。MLR的线性拟合值为0.9915,PLS的线性拟合值为0.8313,BPNN线性拟合值0.99239,表明构建的神经网络模型具有较高的准确性和重现性。对MLR所建的模型进行F检验,可判定此方程显著。利用MLR、PLS和BPNN所建的模型分别对分离鉴定两个鸭肫抗氧肽DKFILK和SSYEGIELIIK验证,与ORAC活性值和氨基酸结构分析结果一致,进一步证实了组分DKFILK抗氧化活性更高。鸭肫抗氧化肽DKFILK的活性与其氨基酸组成及结构具有一定的关联。(5)鸭肫抗活性肽对人体前列腺增生细胞(BPH1)的抗氧化能力及其机理。不同浓度的鸭肫活性肽在作用48 h后,能明显抑制BPH细胞的增殖,促进其凋亡并且阻滞其细胞周期;当鸭肫活性肽的质量浓度为200310-3 g/L时,细胞中超氧化物岐化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活力分别提高了26.16%、20.24%和69.41%;采用qRT-PCR检测得出,细胞中CAT和GSH-Px mRNA的表达水平升高,SOD mRNA表达不明显,与鸭肫活性肽浓度呈正相关。鸭肫活性肽通过上调细胞内CAT和GSH-Px mRNA表达水平来削弱细胞自身的氧化损伤作用,发挥其抗氧化作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51

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本文编号：2295352