水稻组织特异型合成启动子的构建、双向启动子的鉴定及OsPGIP1在抗纹枯病中的功能研究
发布时间：2018-12-06 18:33
【摘要】：植物生长发育、形态建成以及环境适应与基因在特定时期、空间和信号刺激下的特异表达息息相关,而基因表达模式的多样性取决于从转录到翻译各级不同水平的调控。在整个基因表达调控系统中,启动子作为转录水平上的重要调控元件,是基因表达的“开路者”。启动子能够有效调控下游基因表达的起始、关闭以及丰度,同时在转录调控机理的研究中也扮演着重要的角色。因此,对启动子的深入研究具有巨大的应用潜力和理论价值。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,亦是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。完备的基因组信息及较为清楚的基因表达信息为组织特异表达合成启动子、顺式调控元件以及双向启动子的研究提供了极大的便利。纹枯病对水稻的生长、发育和生产造成大面积的严重危害。由于现有水稻种质资源中没有对纹枯病具有完全抗性的品种,抗纹枯病的主效QTL也没有得到鉴定,同时抗纹枯病转基因育种受到候选基因的巨大限制,因此水稻抗纹枯病育种长时间以来都没有取得巨大突破。近年来,大量研究表明多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)可以阻止病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)对植物细胞壁的降解,从而提升植物对病原菌的抗性。本研究的工作内容和获得的成果主要分为三个部分:一、水稻新型组织特异表达合成启动子的构建及顺式调控元件的筛选和功能分析;二、水稻内源双向启动子的分离鉴定和功能分析;三、Os PGIP1基因在水稻抗纹枯病中的功能研究。1.本研究首先将七个功能清晰的水稻组织特异表达相关调控序列以不同方式进行融合,最终获得了五个新的绿色组织特异表达的合成启动子,分别是:GSSP1、GSSP3、GSSP5、GSSP6和GSSP7。随后,在水稻全基因组水平上对不同组织特异表达基因的启动子区域进行顺式元件扫描及统计,得到10个在绿色组织特异表达基因的启动子区域中高频出现的顺式元件。结合生物信息学分析及试验验证,最终分离克隆了一个可用于合成水稻绿色组织特异表达启动子的通用序列5’-AAAATATTTAT-3’(下划线序列表示核心元件,本研究中命名为GEAT),并对GEAT的侧翼序列进行了详细的功能分析。该研究结果为组织特异表达合成启动子的研究、全基因组水平组织特异表达顺式调控元件的筛选、鉴定及其侧翼序列功能分析提供了一个可借鉴的方法。2.本研究结合MSU和RAP数据库中的RNA-seq数据以及CREP数据库中的表达谱芯片数据在水稻基因组中选取了四个候选双向启动子,分别命名为:BIP1,BIP2,BIP3和BIP4。通过转基因水稻中的功能鉴定证实它们均具有双向表达活性。然后对其中一个双向启动子BIP1进行5’和3’缺失分析,鉴定出其双向表达调控区段以及控制其5’和3’方向基本表达活性的区段。随后,利用生物信息学手段分析了这四个双向启动子的保守性,并鉴定出可能与双向表达相关的两个新的顺式序列。本研究建立了一个双向启动子的筛选、克隆、功能分析以及寻找双向表达调控区段和双向表达相关的顺式序列的完整方法。3.本研究将Os PGIP1基因在大肠杆菌中进行原核表达,纯化出Os PGIP1蛋白。水稻纹枯病菌PG酶的活性抑制试验证明Os PGIP1对纹枯病菌PG酶具有明显的抑制活性。另外,我们通过水稻原生质体和洋葱表皮细胞的亚细胞定位试验进一步确定其发挥功能的位置。在获得超表达Os PGIP1基因单拷贝纯合株系后,我们利用Real-time PCR检测转基因纯合植株中Os PGIP1的表达量。田间纹枯病菌接种试验显示转基因植株对纹枯病的抗病性有明显提高,并且抗性提高水平与Os PGIP1的表达量水平一致。本研究结果不仅阐述了Os PGIP1基因的功能及其可能的作用机制,也为抗纹枯病水稻培育提供了一条新思路。
[Abstract]:Plant growth, morphogenesis and environmental adaptation are closely related to the specific expression of genes under specific time, space and signal stimulation, while the diversity of gene expression patterns depends on the regulation of different levels from transcription to translation. In the whole gene expression regulation system, the promoter is an important regulatory element on the transcription level, and is a 鈥渙pen-circuit鈥，
本文编号：2366468
[Abstract]:Plant growth, morphogenesis and environmental adaptation are closely related to the specific expression of genes under specific time, space and signal stimulation, while the diversity of gene expression patterns depends on the regulation of different levels from transcription to translation. In the whole gene expression regulation system, the promoter is an important regulatory element on the transcription level, and is a 鈥渙pen-circuit鈥，
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