三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究

发布时间：2018-12-11 22:17

【摘要】：蛋白酶是一类催化蛋白质肽键水解的重要工业用酶,广泛存在于动植物及微生物中,在生物体中执行着不同的生理功能。本论文系统研究了三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的分离纯化、酶学性质及应用研究,论文得出的主要结论如下：测定了90种植物样品提取液的蛋白酶活性,其中10种水果和14种蔬菜的蛋白酶活力在10 U/g以上。除菠萝、无花果和木瓜等商品化蛋白酶来源样品具有高活性外,猕猴桃、西兰花、姜、韭菜和尖椒在不同pH条件下也表现出高酶活力。结合SDS-PAGE、酶谱、蛋白酶类型及肽段分析,这5种植物样品具有新型蛋白酶的开发潜力。选取活力最高的猕猴桃为研究对象,分析7个品种猕猴桃样品粗酶液的蛋白酶、凝乳酶活性和蛋白分布情况,采用徐香猕猴桃开展进一步的研究。猕猴桃粗酶液经过硫酸铵沉淀和QSFF强阴离子交换层析两步纯化得到了电泳级纯酶(Actinidin)。纯酶最适pH和温度分别为3.5和40℃,在pH 3.5-6.0和40℃以下保持稳定。碘乙酰胺对酶活性的强烈抑制作用表明该酶为半胱氨酸蛋白酶。较低浓度的Actinidin(0.25 mg/100 g肉重)对兔肉具有良好的嫩化效果。Actinidin水解5种植物蛋白后,产物的多肽得率最高达14.2%,ACE抑制率最高达88.3%,具有开发ACE抑制肽的潜力。从酱油曲样品中筛选得到一株产蛋白酶细菌CAU342A,经鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。单因素及正交试验优化后其液体发酵产蛋白酶的最适条件为(g/L)：酒糟30,酵母提取物15,吐温-800.5,NaCl 5,K2HPO47, KH2PO43, MnSO40.4,培养基初始pH 7.5,培养温度30℃,发酵3 d,最高酶活力为2653.5 U/mL。粗酶液经过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化得到了电泳级纯酶(PaproA),比酶活力为8477.4 U/mg,回收率为9.8%。SDS-PAGE测定纯酶分子量为32.2 kDa,凝胶过滤层析测定其分子量为34.5 kDa,该酶为单亚基蛋白。纯酶最适pH和最适温度分别为9.0和55℃,在pH 7.0-9.5和60℃以下保持稳定。EDTA对蛋白酶活力具有强烈抑制作用,表明该酶为金属蛋白酶。蛋白酶PaproA其有较广泛的底物特异性,对酪蛋白、脱脂乳和鱼精蛋白水解能力较强,不能水解明胶和胶原蛋白。蛋白酶PaproA在ACE抑制肽和配制酱油的制备中具有应用潜力。成功将米黑根毛霉CAU432中的蛋白酶基因(RmproA)克隆、表达至毕赤酵母中。该基因属于肽酶(Peptidase A1)家族的天冬氨酸蛋白酶,开放阅读框(ORF)为1326 bp,编码442个氨基酸并不含内含子。重组蛋白酶(RmproA)经5 L发酵罐高密度发酵后酶活力为3480.4U/mL。粗酶液经QSFF强阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化得到电泳级纯酶(RmproA),比酶活力为773.3 U/mg。RmproA为单亚基蛋白,SDS-PAGE显示其分子量为52.4 kDa并发生糖基化作用。RmproA的最适pH和最适温度分别为5.5和55℃,在pH 5.0-8.0范围内及50℃以下保持稳定。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对酶活力有显著抑制作用。RmproA对酪蛋白、脱脂乳、偶氮酪蛋白和大豆分离蛋白有较好的水解能力,不能水解鱼精蛋白和胶原蛋白。经RmproA处理的猪肉具有较小的剪切力,表明其在肉类嫩化中具有一定的应用潜能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q814

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