N-聚糖质谱检测新方法研究及应用

发布时间：2018-12-14 22:44

【摘要】：糖基化是生物体内重要的翻译后修饰之一。聚糖主要位于细胞与细胞之间,许多功能重要的蛋白,例如,酶,免疫受体和细胞生长因子受体都被糖基化修饰。越来越多的证据表明糖基结构与其修饰的蛋白一起在细胞生长与发育,肿瘤转移,免疫识别,细胞通讯和微生物入侵等过程发挥极其重要的作用。由于存在不同异头分支和连接形式,糖基化的结构多样性可能超过线性的核酸和蛋白质。糖基化结构多样性源于其非模板化的合成方式,不同的糖基转移酶之间的竞争深刻影响聚糖结构组成和表达的丰度。因而,准确鉴定糖基化组成,相对丰度和位点面临许多技术挑战。本文利用基质辅助激光解析质谱(MALDI-MS)对固定化衍生的唾液酸N-连接聚糖及其同分异构体进行鉴定和相对定量,以期找到与疾病相关的生物标记物。同时探索通过酶化学和固定化方式对糖肽进行富集。MALDI-MS是N-连接聚糖结构鉴定重要技术平台。然而,N-连接聚糖的唾液酸在质谱检测过程中容易发生源内和源后裂解,影响质谱对聚糖的鉴定。文献报道甲胺化可以同时将α(2,3)和α(2,6)连接的唾液酸完全衍生。本文利用新型固定甲胺化衍生方式对N-连接聚糖末端的唾液酸进行衍生。首先将糖蛋白通过还原胺化固定到琼脂糖介质上,然后在固相条件下对唾液酸进行甲胺化衍生。结果表明,固相甲胺化能够对唾液酸完全衍生,同时减少样品损失和污染。标准蛋白胎球蛋白在MALDI每个点的样品量最低0.5μg。与传统溶液中甲胺化相比较,固相甲胺化方法提高了检测的灵敏度和信噪比。应用该方法分析正常人血清和骨髓瘤患者的聚糖谱图,观测到在高分子量区段带岩藻糖聚糖表达量的显著差异。同时通过HPLC-荧光检测验证该方法在鉴定血清标志物的潜力。在固定甲胺化衍生的基础上,进一步发展为一种固定化两步衍生方式实现唾液酸聚糖同分异构体的鉴定。将蛋白固定到琼脂糖介质后,通过两步衍生反应使α(2,6)连接的唾液酸被乙酯衍生,而α(2,3)连接的唾液酸被甲胺衍生。乙酯化衍生使唾液酸分子量增加28 Da,甲胺化衍生使唾液酸分子量增加13 Da,通过两者15 Da的分子量差异分辨聚糖唾液酸的连接方式。固定化两步衍生方法克服了以往衍生方法形成的α(2,3)内酯不稳定的问题,提高了检测重复性。固相两步衍生方法应用到单克隆抗体药唾液酸聚糖的分析时,发现单克隆抗体药的唾液酸全部为α(2,3)连接。最终,我们将固定两步衍生用于肝癌血清标志物的分析,通过受试者工作曲线分析鉴定6种与聚糖整体丰度相关和2种唾液酸同分异构体相关的标志物。相对于PNGase F,内切糖苷酶ENDO-H可以研究高甘露糖型和杂合型聚糖。本文利用内切糖苷酶ENDO-H对RNAse B和Avidin的N-聚糖进行鉴定。同时在ENDO-H酶切过程中,糖肽上保留一个乙酰葡糖胺残基。利用糖肽上保留的乙酰葡萄糖胺残基,通过酶化学法和固定化方法对糖肽进行富集。由于富集到的糖肽带有一个特征性二糖标签,增加了糖肽鉴定的可信度。最终该方法可以同时鉴定蛋白的聚糖结构和糖基化位点。本文在固相条件下实现了对唾液酸的衍生和唾液酸同分异构体的鉴定。由于生成的衍生产物较为稳定,实现对唾液酸聚糖同分异构体的准确相对定量。利用内切糖苷酶ENDO-H实现了对聚糖结构和糖基化位点初步研究。对单克隆抗体药和肝癌样品的分析显示了在生物制药工业和聚糖标记物发现方面广阔的应用前景。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q503

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