小鼠胚胎成纤维细胞mTORC1调控蛋白的鉴定及功能研究

发布时间：2018-12-14 09:35

【摘要】：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一个保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在哺乳动物细胞内主要以：nTOR复合体1 (mTORC1)和mTOR复合体2(mTORC2)的形式存在,其中mTORC1的活性可以被Rapamycin抑制。mTORC1通路在调控细胞生长和增殖方面发挥极为重要的作用。尽管目前已经证实mTORC1通路在多种人类疾病中处于异常活化的状态,比如肿瘤、糖尿病、肥胖和神经退行性疾病等,但是nTORC1通路异常导致人类疾病的分子机制仍然不清楚。调控基因表达是mTORC1的一个重要功能,mTORC1不仅可以在转录水平还可以在翻译水平调控基因表达。然而,到底哪些蛋白受到mTORC1的表达调控,它们在mTORC1的下游发挥怎样的功能,仍然有待进一步的研究。因此,鉴定mTORC1调控蛋白对于研究mTORC1下游功能具有重要的意义。本研究采用iTRAQ技术对WT MEFs、TSC2-/-MEFs、和Rapamycin处理的TSC2-/ MEFs的蛋白质组进行了定量分析,最终鉴定到了58个mTORC1调控蛋白。它们主要参与细胞骨架组装、线粒体功能、内质网功能、转录调控、蛋白质核输入通路、糖酵解通路、脂肪代谢和细胞周期等。首次发现mTORC1活化可以正调控多个蛋白质核输入通路中关键蛋白质的丰度,包括KPNA2、RanGAP1、RanBP2、NUP93和NUP107。我们采用免疫印迹方法对KPNA2、RanGAP1和RanBP2进行了进一步的验证,结果表明在小鼠胚胎成纤维细胞中mTORC1活化正调控这三个蛋白的丰度,这与质谱结果一致。mTORC1对KPNA2的正调控还在其它多种小鼠和人类细胞中得到验证,表明这种调控广泛存在。接着我们对mTORC1调控KPNA2的分子机制进行了探索。结果显示,mTORC1的两个参与翻译调控的经典底物S6K1和4E-BP1均不参与mTORC1对KPNA2的调控；反而mTORC1活化正调控KPNA2 mRNA丰度。这些结果表明,mTORC1对KPNA2的表达调控是在转录水平,而不是在S6K1和4E-BP1依赖的翻译水平。在本研究的蛋白质组学数据中鉴定到了9个糖酵解通路中的酶,它们的丰度在mTORC1活化时全部显著增加(p0.05),在mTORC1的活性受到抑制时全部显著降低(p0.05)。采用Real-time PCR方法,我们进一步证实了mTORC1活化确实可以正调控糖酵解基因的表达。前人的研究表明KPNA2可以参与对糖酵解基因的表达调控。因此,我们推测KPNA2很可能参与了mTORC1对糖酵解基因的表达调控。在mTORC1活化的TSC2-/-MEFs中,敲低KPNA2显著降低了糖酵解基因的mRNA丰度,这说明KPNA2确实参与了mTORC1对糖酵解基因的表达调控。由于KPNA2可以特异地识别并结合转录因子HIF1α的核输入标签(NLS), HIF1α也可以参与mTORC1对糖酵解基因的表达调控,我们进一步考察了KPNA2是否是通过影响HIFlα的丰度或者亚细胞定位进而参与对糖酵解基因的调控。首先证实了mTORC1通过HIF1α调控糖酵解基因的表达,因为mTORC1活化上调HIF1α的丰度,而敲低HIF1α则可以抑制nTORC1诱导的糖酵解基因的表达。然而,敲低KPNA2却对HIF1α的丰度或者亚细胞定位均没有影响,这表明KPNA2是通过一个不依赖HIF1α的方式参与mTORC1对糖酵解基因的表达调控的。进一步的研究表明,HIF1α也不影响KPNA2的蛋白丰度,因为敲低HIF1α不影响KPNA2的蛋白丰度。上述结果表明,mTORC1通过HIFlα和KPNA2调控糖酵解基因的表达是两条平行的、互不影响的通路。总而言之,本研究采用定量蛋白质组学方法,分析了小鼠胚胎成纤维细胞中mTORC1调控的蛋白谱,发现多个蛋白核输入通路和糖酵解通路中的蛋白／酶受到mTORC1的调控；结合多种分子生物学方法,首次发现mTORC1正调控核转运蛋白KPNA2的表达,并且证明了其在mTORC1调控糖酵解基因中发挥重要作用。本研究为探索nTORC1下游功能以及研究mTORC1对糖酵解通路的调控机制提供了重要的参考和研究视角。
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【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q51
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本文编号：2378387