转糖基α-半乳糖苷酶筛选及Globotriose酶法合成研究

发布时间：2018-12-16 22:50

【摘要】：α-半乳寡糖在自然界中广泛存在,具有许多重要的生物学功能,在功能食品及医药业有着重要的应用价值。例如,豆奶中的不易消化的a-半乳寡糖及其结构类似物通常包含Galα1-6糖苷键,这些物质不易被人或其他单胃动物消化,可以作为益生元(prebiotics)进入肠道选择性的促进肠道有益菌群的生长。α-Gal抗原寡糖是一类末端含有Galα1-3糖苷键的糖链,是在非灵长类、原猴亚目、新世界猴等动物体内广泛存在的重要的糖抗原。在进行异种器官移植时,该抗原进入人体后可被人体内的天然α-Gal抗体识别而引起强烈的免疫反应,甚至危及患者生命。在进行异种器官移植时,向患者体内大量注射人工合成的α-Gal抗原寡糖或其衍生物能中和天然抗体,减弱免疫排斥反应。另外,正由于人体中存在天然的α-Gal抗体,α-Gal抗原寡糖也可以用于癌症疫苗的制备,以增加癌症疫苗的免疫原性。另一种重要的α-半乳寡糖globotriose (Galα1-4Galβ1-4Glc),存在于人体细胞表面,是痢疾志贺氏杆菌(Shigella dysenteriae)和肠出血性大肠杆菌(EPEC)产生的志贺氏毒素的受体糖链,志贺氏毒素与globotriose结合会引起一系列毒性反应及并发症,最终引发溶血性尿毒综合征(HUS)导致患者死亡人工合成的globotriose及其衍生物可以模拟天然受体结构并与毒素结合,可以作为亲和抑制剂用于中和毒素及相关疾病的治疗。此外,globotriose还是存在于脑癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌及小细胞肺癌等肿瘤细胞的神经节苷脂如GloboH和SSEA4糖链的核心结构,因此可作为癌症相关糖抗原的合成前体用于癌症疫苗的研发。最近的研究发现,细胞表面或者可溶性的Pk/Gb3组织血型抗原末端的半乳双糖(Galα1-4Gal)结构或者类似物可以通过与HIV-1病毒的包膜蛋白结合以抑制病毒在靶细胞表面的吸附,揭示了globotriose及其衍生物可以作为新的治疗方法用于HIV/AIDS的治疗的可能。虽然寡糖及其结构类似物应用于食品和药品具有巨大的潜能,但是由于这些生物分子的结构复杂而导致其大量制备十分困难。目前寡糖的合成方法包括化学法及酶法合成。由于糖分子中多个可以参与反应的羟基,化学法合成特定的糖苷键需要多步的保护及去保护操作,步骤繁琐。而酶法合成糖苷键一步完成,可以在不对其它羟基进行保护的情况下保证合成的区域选择性和立体选择性,步骤简单,而且可以在不对其它羟基进行保护的情况下保证合成的区域选择性和立体选择性,因而在寡糖合成方面具有一定优势。一步法合成寡糖反应中应用的两类酶分别是糖基转移酶(glycosyltransferases)和糖苷酶(glycosidases)。糖基转移酶是生物体内天然合成寡糖或者聚糖的酶,立体选择性和区域选择性好,反应效率高,但是糖基转移酶需要价格昂贵的活化的糖核苷酸作为糖基供体,不利于体外规模化合成反应。糖苷酶又称为糖苷水解酶,通常是天然条件下对聚糖或者糖缀合物上的糖苷键进行水解的一类酶,但是某些种类的糖苷酶在体外条件下,也可以利用简单糖类为糖基供体催化糖基化反应(glycosylation)或者转糖基反应(transglycosylation)合成糖苷键,生成各类糖类化合物。由于糖苷酶催化糖苷键合成的糖基供体可以为单糖、寡糖及其他糖苷类化合物,因此可以低成本、大规模的合成寡糖及其衍生物,因而该类酶的合成能力受到广泛关注。α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是一类重要的糖苷酶,该酶天然情况下可以水解除去多种寡糖或者糖缀合物末端的半乳糖基。根据氨基酸序列相似性,α-半乳糖苷酶归属于糖苷酶家族GH4、GH27、GH36、GH57、GH97和GH110(http://www.cazy.org/)。已有具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶应用于半乳寡糖和糖苷的合成报道,大部分已知的转糖基α-半乳糖苷酶能够催化合成Galα1-3或者Galα1-6糖苷键,只有极少数α-半乳糖苷酶能够催化合成Galα1-4糖苷键,包括水苏属(Stachys affinis)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) 100-16/100-23来源的α-半乳糖苷酶以及本实验室报道的来源于短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)203的α-半乳糖苷酶。目前仅有短双歧杆菌的酶能以甲基乳糖苷为受体催化合成globotriose衍生物,但区域选择性不严格,合成两种异构产物。因而筛选新的具有转糖基活性、区域选择性专一的α-半乳糖苷酶对于药用寡糖及糖缀合物的合成具有重要意义。本论文首先进行了具有转糖基活性的α-半乳糖苷酶的筛选,目标是以乳糖为糖基受体筛选获得能够合成Galal-4糖苷键的糖苷酶。通过TAIL-PCR技术和常规PCR技术克隆了不同微生物来源的9个α-半乳糖苷酶基因,即干酪乳杆菌(Lactobacillus casei) JCM1134 α-半乳糖苷酶基因agaLc (2295 bp),短乳杆菌(Lactobacillus breve) JCM1059 α-半乳糖苷酶基因agaLb737 (2214 bp),产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) ATCC13124 α-半乳糖苷酶CPF 0491基因(2205bp),以及脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis) NCTC 9343来源的α-半乳糖苷酶BF1418、BF4189、BF0233、BF0498、BF0803、BF0227基因(大小分别为1503bp、1491 bp、2160 bp、2169 bp、2076 bp、1593 bp)。将这些α-半乳糖昔酶基因与pBAD/His A载体连接转化表达宿主E. coli LMG194,构建基因工程菌用于重组酶的诱导表达。9个重组α-半乳糖苷酶均可以表达出可溶性蛋白,重组酶粗酶液均表现出对对硝基半乳糖苷(p-nitrophenyl-a-D-galactopyranoside,pNPαGal)的水解活性。用重组酶粗酶液催化以pNPaGal为供体、乳糖为受体的转糖基反应研究结果说明,除BF0803外,其余8个重组酶均可以催化合成以乳糖为受体的转糖基产物。其中CPF 0491、BF0233和BF0227合成的转糖基产物经TLC检测与globotriose标准品迁移率一致,转糖基产物进一步经高效阴离子交换色谱(HPAEC)检测,发现只有BF0227的转糖基产物与globotriose标准品保留时间一致。对转糖基产物进行乙酰化修饰,NMR分析结构表明该产物为半乳糖以α1-4糖苷键与乳糖连接的寡糖,这是首例可以以天然乳糖为受体催化合成Galα1-4糖苷键的α-半乳糖苷酶,因此后续的研究工作均围绕BF0227开展。进一步研究表明,由于重组酶BF0227在已经构建的大肠杆菌表达系统中无法实现Ni-亲和层析纯化。该酶基因大小为1593 bp,编码约58.3KDa的蛋白,属于GH27家族,根据SignalP4.1分析,其N-端的24个氨基酸为预测的理论信号肽序列。进而克隆BF0227基因去除的N-端信号肽编码的核苷酸序列,命名为agaBf3S,构建基因工程菌E. coli LMG194/pBAD/His A-agaBf3S,对重组酶AgaBf3S进行诱导表达,经过Ni-亲和层析纯化得到AgaBf3S纯酶,分子量约59.2kDa。对其进行酶学性质研究,在进行水解反应时,AgaBf3S最适pH 4.5,在pH4.0-11.0范围内稳定,最适温度40℃,温度高于40℃时迅速失活。重组酶AgaBf3S受各种离子的影响较小,为非离子依赖的酸性中温糖苷酶。AgaBf3S可高效水解pNPαGal,当以oNPαGal底物时,其水解活力为pNPαGal水解活力的37.58%,对其它底物如mNPaGal、β-糖苷键连接底物或非半乳糖硝基苯糖苷均没有水解活性。对AgaBf3S水解人工及天然底物的Km和kcat分别进行的测定结果表明,AgaBf3S水解pNPαGal、蜜二糖和globotriose的Km和kcat值分别为1.27mM和172.97 S-1,62.76 mM和7.74 S-1,4.62 mM和388.45 S-1; AgaBf3S水解pNPaGαl、蜜二糖和globotriose的kcat/Km值分别为135.88 mM-1S-1,0.28 mM-1S-1, 84.12mM-1S-1。以上三种底物中,AgaBf3S对pNPαGal的亲和力和水解效率均最高,说明pNPαGal较合适作为转糖基反应供体。将AgaBf3S以pNPaGal为供体、以乳糖为受体进行转糖基反应,并对反应条件进行优化,研究了底物浓度、pH、温度等对产物产率的影响,确定产物产率最高的反应条件为：起始乳糖浓度500 mM、pNPαGal浓度20 mM、酶浓度0.6 U/mL,在100 mM pH 4.5NaAc缓冲液中40℃反应30 min,此时产物(命名为PLac)产率为32.4%。对产物进行分离纯化,并将其1H NMR谱及1H,13C-HSQC谱与globotriose的标准品的相关谱图进行比较,结合TLC迁移率、质谱结果、HPAEC保留时间分析,确定该转糖基产物为globotriose。该结果显示AgaBf3S是一步法合成globotriose的新型工具酶。进一步研究了该酶的转糖基受体选择性,以多种二糖、单糖和糖醇为受体建立转糖基反应,结果表明AgaBf3S可以在纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖等二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖等醛糖为受体时合成转糖基产物,并且受体非还原端为半乳糖时产物产量较高,在以山梨糖、果糖等酮糖,甘露醇、山梨醇等糖醇以及木糖和鼠李糖为受体时无转糖基产物生成,说明糖基受体糖环结构、羟基位置,尤其是C-4上羟基的键型对于AgaBf3S的受体选择性具有十分重要的影响。进一步通过随机突变与定点突变相结合的方式获得了转糖基效率提高的突变酶,同时对AgaBf3S受体选择性相关的氨基酸位点进行了研究。α-半乳糖苷酶催化合成反应时遵循糖苷酶的一般作用机制,在反应后期还会对转糖基产物进行二次水解,因此产物产量不高。为了提高AgaBf3S催化合成globotriose的产率,对AgaBf3S进行了随机突变研究,确定了2个对转糖基产物产率有较大影响的氨基酸位点,并对这两个氨基酸位点进行了不同类型的氨基酸替换,最终得到了突变酶A141W和H426S,其转糖基产物产率分别为36.06%和38.25%,与原始酶(产率为32.4%)相比,产率分别提高了11%和18%。通过对AgaBf3S进行同源模建(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index,模板为链霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680)来源的β-L-阿拉伯糖苷酶Arap27A),根据其三维模拟结构发现,A141位于催化腔的腔口,可能是由于该位点的丙氨酸突变成了非极性的色氨酸后导致反应腔内水活度降低,转糖基产物可以大量积累。通过结构比对,推测出多个与AgaBf3S催化活性相关的重要氨基酸位点,其中D135为亲核位点,D191为酸碱催化位点,D48、K133、C170、R187为底物结合位点,Y101、W172、P194为推测的配体结合位点。通过氨基酸定点突变进一步确定了W172为受体结合相关位点,该位点的色氨酸突变为苯丙氨酸后,可以以pNPαGal为受体合成大量自转产物,而原始酶不以pNPαGal为受体合成自转产物,说明该位点氨基酸的替换改变了酶的受体选择性。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55
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本文编号：2383175