多氯联苯污染环境样品中非可培养状态菌的复苏及形成机理研究

发布时间：2018-12-19 10:07

【摘要】：活的但非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态是微生物应对各种环境压力的一种生存机制。藤黄球菌等微生物的复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)可将 VBNC 状态菌复苏。目前关于 VBNC菌及其复苏研究主要集中在病原菌及流行病学领域。有机异生质污染土壤、底泥等环境中大量微生物受胁迫处于VBNC状态,对其进行复苏研究,有望提高有机污染物微生物降解修复能力,获得高效降解新种资源,并有助于揭示微生物VBNC诱导及其复苏机理。本研究通过响应面分析法(response surface methodology,RSM)优化藤黄球菌含Rpf胞外分泌物(extracellular organic matter,EOM)的蛋白产量;以多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)污染土壤或底泥为富集源,研究藤黄球菌EOM对富集培养体中菌体生长、联苯降解性能、菌群结构及多样性的影响;同时分离培养、鉴定EOM添加组特有的菌株,选择联苯(biphenyl,BP)/PCBs降解性能最高的菌株进行多相分类鉴定,确定其新种分类地位;并通过低温和贫营养诱导新种菌株进入VBNC状态,研究其形态、酶活性及基因转录水平方面的变化,以期揭示VBNC状态的形成机理。研究主要结果如下:(1)采用PBD(Plackett-Burman Design)设计法以蛋白产量为响应指标,从培养基成分与培养条件中筛选出4个显著因素。然后采用中心组合设计(central composite design,CCD)响应面分析法获得藤黄球菌EOM产蛋白的优化条件:矿物盐溶液1.5ml/L、L-乳酸锂盐8.75g/L、pH=7.5、培养时间48h。EOM主成分分析表明,EOM既含有多糖又含有蛋白质,分别为405.74和25.13 mg/L。由凝胶色谱层析结果可知,多糖主要是分子量为4422 Da的低聚糖,主要蛋白质分子量为11489 Da和9562 Da。克隆表达所得的Rpf重组蛋白分子量为45 KDa,是理论值的1.25倍。(2)PCBs污染土壤或底泥来源的添加EOM的富集培养体,其耐受BP浓度和BP降解效率及菌群多样性有明显提高,菌群结构也发生明显变化。对比EOM添加组和灭活EOM添加组可知,EOM中的蛋白质起到关键作用。结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和16S rRNA基因高通量测序结果发现,EOM显著促进放线菌门(Actinobacteria)的红球菌属(Rhodococcus)和变形菌门(Proteobacteria)的假单胞菌属(Pseudomonas)的菌群生长。同时,在被试的三组不同PCBs污染底泥样中,EOM对PCBs浓度最高的SS3底泥样影响最大,且Actinobacteria门的Rhodococcus属及其它的未可培养菌群可能是其中被复苏的高效降解菌群。从处理组分离的特有菌株归属于9个菌属,大部分为Actinobacteria。其中Rhodococcus属菌株TG9具有最强的BP/PCBs降解性能,其耐受BP浓度可达3000mg/L,菌株TG13次之,且两者均可以降解BP开环代谢产物苯甲酸。(3)选择BP/PCBs降解性能最强的菌株TG9T进行多相分类鉴定。结果表明,除4个模式菌株(Rhodococcus gordoniae DSM 44689T、Rhodococcus pyridinivorans DSM 44555T、Rhodococcus rhodochrous DSM 43241T和Rhodococcus artemisiae DSM 45380T)外,菌株TG9T与其它菌株16S rRNA基因序列相似性均低于98%。且菌株TG9T与4个模式菌株在生长温度范围、pH范围、盐浓度范围、碳源利用、氮源利用、产酸底物、底物水解和抗生素敏感等表型特征上存在差异。同时,它具有以下化学分类特征:属于典型的细胞壁Ⅳ型细菌,脂肪酸主要组分为C16:0,细胞极性脂组分包括磷脂、糖脂和未确定极性脂,甲基萘醌MK-8(H2)是唯一的醌组分,且细胞中存在枝菌酸甲基脂组分。另外,它的G+C含量为62.8 mol%,且与4个模式菌株DNA-DNA同源性均低于50%。基于菌株TG9T的表型、化学分类及基因型特征分析可知,它与4个模式菌株存在差异,因此,确定菌株TG9T的新种分类地位,命名为Rhodococcus biphenylivorans(嗜联苯红球菌)。(4)将菌株R.biphenylivorans TG9T在低温和贫营养条件下进行VBNC状态诱导。结果表明,145d后其可培养数降低至0.1 CFU/mL,即进入VBNC状态。将VBNC状态菌悬液涂布于LB(Luria-Bertani)固体培养基,30℃培养3d后即恢复可培养状态。由形态及酶活分析可知,VBNC细胞呈现萎缩,明显小于对数生长期细胞,且荧光强度也明显减弱。复苏细胞的大小和荧光强度均介于VBNC细胞和对数生长期细胞之间。同时,三种细胞均具有API ZYM试剂盒19种酶中的8种酶活性,而在VBNC细胞中的活性低于对数生长期细胞。高通量转录组测序结果表明,VBNC细胞与对数生长期细胞相比共有2097个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),上调和下调基因分别为1452和645个,虽然上调基因要多于下调基因,但是差异倍数在20倍以上的上调和下调基因分别为17和42个。综合GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径富集分析可知,进入VBNC状态后,其上调基因主要涉及ATP积累(ATP accumulation)、蛋白修饰(protein modification)、肽聚糖合成(peptidoglycan biosynthesis)和RNA聚合酶(RNA polymerase)。下调基因主要与氧化还原过程(oxidation-reduction process)和氨基酸代谢(amino acid metabolism)相关。综上所述,本论文研究结果为探索新的异生质高效降解菌资源开辟了新的途径,为开发基于VBNC菌复苏从而促进土壤有机污染微生物修复的新技术奠定了理论基础,并为揭示异生质降解菌株的VBNC状态诱导-复苏机理进行了有益的探索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172
，

本文编号：2386770