应用模型细胞膜探究二氧化硅纳米颗粒对细胞膜结构和相态的影响

发布时间：2019-02-27 15:30

【摘要】：纳米二氧化硅是使用量最多的纳米材料之一,具有较高的化学稳定性,在制药、医疗、生物科技等方面具有广泛应用,这增加了生物体与其接触的机会。有研究报导尘肺病等疾病的产生与长期接触二氧化硅纳米颗粒(SiO_2 NP)有关,但是其致病机理仍不明确。SiO_2NP与细胞膜的直接接触是导致细胞毒性的重要途径。因此,本论文对SiO_2NP与细胞膜的相互作用进行了深入研究。细胞膜结构的完整性和相态的流动性是细胞进行正常生命活动的必要条件,本论文基于细胞膜这两个与功能相关的结构特点探究了纳米颗粒对细胞膜完整性和相态流动性的影响。由于细胞的代谢活动会干扰对纳米颗粒与细胞膜界面作用的认识,本论文采用人工生物膜——大单层囊泡(GUV)和小单层囊泡(SUV)作为细胞膜模型,研究不同分散状态以及表面修饰的Si02NP对细胞膜的影响。此外,本论文还从RBL-2H3细胞中提取了质膜囊泡(GPMV)作为介于真实细胞膜和人工生物膜之间的细胞膜模型,从分子水平讨论了纳米颗粒改变细胞膜相态的机理,进一步完善了关于纳米颗粒与细胞膜界面作用的认识,为纳米材料的安全使用提供重要信息。1.SiO_2等纳米氧化物对模拟细胞膜结构和流动性的影响本研究比较了 SiO_2 NP及其它四种常用的纳米氧化物Al_2O_3、Fe_2O_3、TiO_2、ZnO与模拟细胞膜的界面作用。实验结果表明,在静电作用下Al_2O_3和SiO_2NP破坏了带有相反电性的细胞膜完整性。然而Fe_2O_3、TiO_2和ZnONP并没有对细胞膜造成明显的破坏。将相态指示探针Laurdan加入模拟细胞膜中,其荧光光谱表明SiO_2 NP能够使细胞膜向胶态化转变。而Al_2O_3和ZnO NP仅使电性相反的细胞膜向胶态化转变。通过傅里叶红外光谱技术(FT-IR)探究纳米颗粒对磷脂分子结构的影响,结果表明Al_2O_3和SiO_2NP会结合磷脂分子的羰基或者磷酸基团形成氢键。其中,SiO_2NP与细胞膜之间的氢键作用更强。因此,氢键作用使Al_2O_3和SiO_2NP破坏了细胞膜的结构,改变了细胞膜的相态。2.不同分散状态和表面修饰的SiO_2 NP对磷脂层的影响由于SiO_2NP对细胞膜造成的损伤更为严重,选取不同分散状态及表面修饰的SiO_2NP,深入探讨了 SiO_2NP对模拟细胞膜GUV结构和相态的影响。研究发现静电吸引促进颗粒与磷脂分子之间形成氢键,几种不同的SiO_2 NP均对相反电性GUV的形态破坏更严重,但对电性相同的GUV破坏作用较弱。增加SiO_2 NP的暴露时间和剂量加剧了膜损伤。此外,由于纳米颗粒易沉积增大了颗粒物与GUV的接触机率,快速沉降的SiO_2NP粉末对GUV破坏程度要强于稳定分散的SiO_2 NP胶体。相态指示探针Laurdan的荧光光谱表明负电的SiO_2 NP引起细胞膜的胶态化;而经过表面修饰带正电的SiO_2 NP对正电性和电中性的GUV的相态影响不明显,但是能够使电负性的GUV向胶态移动。3.SiO_2 NP吸附腐殖酸和蛋白质后对细胞膜的影响SiO_2 NP排放进入环境后会带来健康风险。SiO_2 NP在自然界中容易吸附腐殖酸(HA)等天然有机物,在人体体液中则容易吸附蛋白质等生物分子,这会改变颗粒的表面性质和生物毒性,从而影响SiO_2 NP与细胞膜之间的相互的作用。因此牛血清蛋白(BSA)和腐殖酸被用来处理SiO_2 NP(BSA-SiO_2 NP和HA-Si02 NP),探究吸附BSA或HA后的SiO_2 NP对模拟细胞膜完整性和相态的影响。显微观察表明,与裸颗粒相比BSA-和HA-SiO_2 NP对GUV的破坏作用较慢,而BSA-SiO_2 NP对GUV的破坏作用最弱。这是因为BSA和HA覆盖了 SiO_2 NP表面的Si-OH以及SiO-,从而减弱了 SiO_2NP与磷脂分子之间的相互作用。石英晶体微天平测定表明BSA-SiO_2 NP吸附在未破裂的SUV表面,而HA-SiO_2 NP和裸颗粒则迅速引起SUV破裂。吸附BSA和HA后的Si02 NP对细胞膜相态的改变不同于裸颗粒,其中HA-SiO_2 NP使细胞膜胶态化最显著,而BSA-SiO_2 NP对细胞膜的相态影响最弱。因此,蛋白质能够有效地减弱SiO_2NP对细胞膜完整性和相态的影响。4.SiO_2 NP对质膜囊泡相态的影响由于人工生物膜的组成成分与真实细胞膜存在差异,本论文从RBL-2H3细胞中提取质膜囊泡作为介于真实细胞膜和人工生物膜之间的细胞膜模型,并研究细胞膜分子组成在Si02NP改变细胞膜相态过程中的作用。研究发现,用甲基-β-环糊精去除膜内胆固醇的GPMV与SiO_2 NP接触后,膜相态向胶态移动更显著。实验使用PFA/DTT和NEM两种起泡剂刺激细胞起泡制备磷脂组成不同的GPMV。其中PFA/DTT起泡剂会减少细胞膜中的脑磷脂(PE)和磷酸肌醇(PI)的含量,NEM起泡剂制备的GPMV磷脂组分接近原细胞膜。实验结果表明,去除PE和PI的GPMV暴露在SiO_2 NP中其相态向胶态化转变更显著。此外,温度升高时GPMV受SiO_2 NP影响后胶态化更严重。由于细胞生命活动需要隔离的胞内空间和流动态的细胞膜来支持膜蛋白并控制物质进出,对细胞膜完整性和流动性的破坏很可能是细胞毒性的重要机制。同时全面了解SiO_2 NP与细胞膜的界面作用,对设计更安全的纳米材料有一定的指导价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X171.5
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本文编号：2431389