二种特定重复序列蛋白的高效表达及生化工程应用研究
发布时间：2019-07-25 08:32
【摘要】：类胶原蛋白(collagen like protein, CLP)和类弹性蛋白多肽(elastin like polypeptides, ELP)是一类含有高度重复氨基酸序列的蛋白质,能够自组装成二级或高级结构,具备特殊的生物功能,在生物医学材料和组织工程等领域都有重要的应用。本文开展了这一类含特定重复序列蛋白质的高效表达及在多个领域中的应用研究。本文首先开展了类人胶原蛋白(human like collagen, HLC)在大肠杆菌中的重组表达研究。通过将HLC、脯氨酸羟化酶和D-阿拉伯糖-1,4-内酯酶基因同时导入大肠杆菌,实现了HLC的高效表达。结果表明：以MBL为培养基,在优化的培养和诱导条件下,摇瓶条件下,重组HLC产量达到49.55 mg/L。在10L发酵罐上流加葡萄糖培养,重组HLC产量提高到0.26g/L。最后通过亲和纯化获得的重组HLC经液相测定发现脯氨酸的羟化率达到10%。然后,开展在大肠杆菌中表达类胶原蛋白(化脓链球菌Scl2)的研究。将GERGFPGERGVE、GRPGKPGKQGQK和RGD等位点整合进入Scl2基因(Scl2-M)并在大肠杆菌中进行表达。在10L发酵罐上经流加甘油,重组Scl2-M的产量提高到15.23g/L。经亲和纯化获得重组Scl2-M且纯度为94.5%,回收率为73.1%,且重组Scl2-M对细胞THP-1具有良好的粘附作用。进一步建立了以Scl2-M为融合标签,纯化人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor, hbFGF)的工艺路线。经流加甘油,融合蛋白在10L发酵罐上的产量为11.32g/L,相应hbFGF的产量为3.83 g/L。经亲和纯化、酶切和离子交换等步骤,获得hbFGF和Scl2-M且回收率分别为38.3%和53.4%。最后,经MTT法测定发现20 ng/mL hbFGF就可有效促进细胞NIH3T3的增殖。最后开展利用在大肠杆菌中表达ELP与L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase, LGOX)融合蛋白质的研究。在30 L发酵罐上对重组菌进行分批和补料分批培养,流加甘油后,融合蛋白LGOX-ELP的酶活最高达74.25 U/mL。利用ELP可逆相变特性获得LGOX-ELP并经蛋白酶K酶切,获得成熟LGOX,且相对酶活为98.14 U/mg,回收率为64.4%。获得的LGOX用于催化生产α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)的研究。首先在3L反应器中优化了游离酶和固定化酶的催化反应条件,在补加底物和过氧化氢酶条件下,a-KG和丁二酸浓度分别为142.5 g/L和18.7 g/L。并在800 L反应器中开展了固定化酶的重复催化研究,结果表明该固定化酶在800 L反应器上可反复使用25次且a-KG的平均生产速率约为6.08 g/L/h,L-谷氨酸的转化率达94.5%。总之,本论文不仅在大肠杆菌中获得了羟基化的HLC,还进一步对Scl2进行研究并利用其作为融合标签制备获得hbFGF。利用ELP可逆相变并结合蛋白酶K酶切,制备了成熟LGOX并用其催化生产了具有高附加值的α-KG。
【图文】：
Ｈ联体重复序列组分，其中Ｘａａ通常为脯氨酸，Ｙａａ经常为送脯氨酸戎客赖氨酸。逡逑它巧基本结构是原胶原，，k胃鲈涸肿佣加赏跆酰岱袅醋槌桑鴎胃觯岱袅炊煎义匣嵝纬勺笫致菪继踝笫致菪ぴ谝黄鹦纬梢桓龃蟮挠沂致菪峁梗ㄍ迹保保ｅ义辖涸鞍椎闹掷喽啵峁垢丛樱壳胺⑾值慕涸鞍字辽儆校玻钢郑浠窘徨义瞎谷创笸∫臁＝涸鞍拙哂兄С牌鞴⒈；せ宓墓δ懿⑶一褂胂赴莞胶拖稿义习ㄒ朴泄亍ｅ义希慑危慑危慑义希海危慑澹慑义希粒拢缅义贤迹保苯涸鞍椎耐跷菪峁瑰义希疲椋纾澹保卞澹龋酰恚幔铄澹悖铮欤欤幔纾澹铄澹踊酰悖簦酰颍澹箦寤幔翦澹幔颍邋澹觯椋螅酰幔欤椋澹溴澹酰螅椋睿珏澹校模拢哄澹桑拢耍皱澹椋铄澹簦瑁颍澹邋义希洌椋妫妫澹颍澹睿翦澹妫铮颍恚螅哄澹裕酰猓邋澹ǎ粒澹茫校隋澹ǎ拢╁澹幔睿溴澹猓幔欤戾澹幔睿溴澹螅簦椋悖脲澹恚铮洌澹戾澹ǎ茫╁义侠嘟涸鞍自蚴歉萁涸鞍椎奶匦越杏呕蛞胩厥夤δ艿陌被嵝蝈义狭校ü刈楸泶锘竦玫木哂欣嗨平涸鞍滋匦缘牡鞍住＠嘟涸鞍拙哂辛己玫腻义仙镅嗳菪浴⑾赴莞缴⒋傧赴ず椭寡裙δ埽氪程崛』竦玫慕涸义
本文编号：2518967
【图文】：
Ｈ联体重复序列组分，其中Ｘａａ通常为脯氨酸，Ｙａａ经常为送脯氨酸戎客赖氨酸。逡逑它巧基本结构是原胶原，，k胃鲈涸肿佣加赏跆酰岱袅醋槌桑鴎胃觯岱袅炊煎义匣嵝纬勺笫致菪继踝笫致菪ぴ谝黄鹦纬梢桓龃蟮挠沂致菪峁梗ㄍ迹保保ｅ义辖涸鞍椎闹掷喽啵峁垢丛樱壳胺⑾值慕涸鞍字辽儆校玻钢郑浠窘徨义瞎谷创笸∫臁＝涸鞍拙哂兄С牌鞴⒈；せ宓墓δ懿⑶一褂胂赴莞胶拖稿义习ㄒ朴泄亍ｅ义希慑危慑危慑义希海危慑澹慑义希粒拢缅义贤迹保苯涸鞍椎耐跷菪峁瑰义希疲椋纾澹保卞澹龋酰恚幔铄澹悖铮欤欤幔纾澹铄澹踊酰悖簦酰颍澹箦寤幔翦澹幔颍邋澹觯椋螅酰幔欤椋澹溴澹酰螅椋睿珏澹校模拢哄澹桑拢耍皱澹椋铄澹簦瑁颍澹邋义希洌椋妫妫澹颍澹睿翦澹妫铮颍恚螅哄澹裕酰猓邋澹ǎ粒澹茫校隋澹ǎ拢╁澹幔睿溴澹猓幔欤戾澹幔睿溴澹螅簦椋悖脲澹恚铮洌澹戾澹ǎ茫╁义侠嘟涸鞍自蚴歉萁涸鞍椎奶匦越杏呕蛞胩厥夤δ艿陌被嵝蝈义狭校ü刈楸泶锘竦玫木哂欣嗨平涸鞍滋匦缘牡鞍住＠嘟涸鞍拙哂辛己玫腻义仙镅嗳菪浴⑾赴莞缴⒋傧赴ず椭寡裙δ埽氪程崛』竦玫慕涸义
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