人博卡病毒（HBoV1）感染性克隆的构建及其NS1和NS1-70蛋白对NF-κB信号通路的调节
发布时间：2019-08-08 16:23
【摘要】：本论文包括硕博连读期间的两个研究项目,分别围绕HBoV1感染性克隆的构建和HBoV1对天然免疫的调节展开。第一部分,我们成功构建了插入了EGFP基因的全长HBoV1感染性克隆(pIHBoV1wh-GFP)。感染性克隆的构建,是开展基础病毒学研究的基础工作。在这篇文章中,我们首先构建了武汉株博卡病毒的感染性克隆pIHBoV1wh。并验证了pIHBoV1wh在HEK293T细胞中转录、复制和产生病毒粒子的能力。同时,我们构建了插入了EGFP基因的全长HBoV1克隆pIHBoV1wh-GFP。pIHBoVwh-GFP能够在转染的HEK293T细胞中转录、翻译、复制和产生子代病毒(HBoV1wh-GFP),并且包装的病毒基因组是全长的。由于EGFP蛋白高度灵敏,易于检测,因此为寻找新的易感宿主提供了有力工具。同时,可以作为转基因治疗的载体,携带更大的基因,用于治疗肺部疾病。第二部分,我们证明了HBoV1 NS1、NS1-70蛋白可以抑制NF-κB信号通路的激活。HBoV1属于细小病毒科,是在世界范围内引起婴幼儿急性呼吸道感染的单链DNA病原体。NF-κB转录因子通过激活许多生理过程在入侵病毒的清除中发挥关键作用。以前的研究表明,HBoV1感染可以显著上调TNF-α的水平,而TNF-α是NF-κB信号通路的强刺激物。我们这篇文章主要探索HBoV1蛋白是否调节TNF-α介导的NF-κB信号通路激活。我们发现HBoV1 NS1和NS1-70蛋白抑制TNF-α刺激的NF-κB激活。NS1和NS1-70蛋白可以抑制TNF受体相关因子2(TRAF2)、IκB激酶α(IKKα)、IκB激酶β(IKKβ)、IKKβ持续性激活型突变体(IKKβSS/EE)或p65-诱导的NF-κB激活。此外,NS1和NS1-70不抑制TNF-α介导的IκBα磷酸化和降解,也不抑制p65的入核。免疫共沉淀实验证实NS1和NS1-70与p65的相互作用。值得注意的是,NS1抑制TNF-α介导的p65 ser536位点磷酸化,而NS1-70不抑制。我们的研究结果揭示HBoV1 NS1和NS1-70蛋白抑制NF-κB激活。我们证明HBoV1可以抑制NF-κB信号通路激活,为揭示HBoV1的免疫逃避机制,探索其致病性提供了重要依据。
【图文】：
3图 1.1 细小病毒科各个属的进化树分析。基于病毒复制起始蛋白 NS1 的氨基酸序列的系统发育分析。FIG 1.1 Phylogenetic tree showing genera in the family Parvoviridae. Phylogenetic analysis basedon the amino acid sequence of the viral replication initiator protein, NS1.1.2.2 HBoV 的形态和结构HBoV 是立体对称的二十面体，直径约 20-26 nm，外侧无囊膜包被（图 1.2）(4)。HBoV 的基因组是单股负义 DNA，全长 5543 个核苷酸。所有脊椎动物的细小病毒都含有相似的基因组结构，，含有用于基因组复制的末端重复序列（发夹结构），非结构蛋白在基因组的左侧，结构蛋白在基因组的右侧(5)。通过昆虫细胞重组表达的衣壳蛋白 VP2 可以自组装成病毒样颗粒（VLP）(6)，人们常用 VLP
图 1.2 HBoV 的二十面体结构。（A）（电子显微镜）用 4％乙酸双氧铀负染鼻咽样品中 HBoV的 EM 照片，放大倍数×60,000。（B）通过氯化铯超速离心从 bacVP2/HBoV 感染的 High-5细胞裂解物中纯化的 HBoV VP2（病毒样颗粒）VLP。纯化的 VP2 蛋白用 2％磷钨酸进行负染用于 EM 分析。（C）HBoV 衣壳结构。HBoV 表面表示低温重建的结构。HBoV 的分辨率为（7.9 ）。FIG 1.2 the structure of HBoV. (A) (electron microscopy) EM of HBoV in Nasopharyngealsamples after negative staining with 4% uranyl acetate, observed at ×60,000. (B) HBoV VP2(Virus-like Particles) VLPs purified from lysates of High-5 cells infected with bacVP2/HBoV bycesium chloride ultracentrifugation. Fractions containing VP2 proteins were prepared for EManalysis by negative staining with 2% phosphotungstic acid. (C) HBoV capsid structures. Stereo,radially color-cued, surface representation of HBoV cryo-reconstruction. HBoV are rendered atthe resolution (7.9 ).
【学位授予单位】：中国科学院武汉病毒研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373;Q78
本文编号：2524467
【图文】：
3图 1.1 细小病毒科各个属的进化树分析。基于病毒复制起始蛋白 NS1 的氨基酸序列的系统发育分析。FIG 1.1 Phylogenetic tree showing genera in the family Parvoviridae. Phylogenetic analysis basedon the amino acid sequence of the viral replication initiator protein, NS1.1.2.2 HBoV 的形态和结构HBoV 是立体对称的二十面体，直径约 20-26 nm，外侧无囊膜包被（图 1.2）(4)。HBoV 的基因组是单股负义 DNA，全长 5543 个核苷酸。所有脊椎动物的细小病毒都含有相似的基因组结构，，含有用于基因组复制的末端重复序列（发夹结构），非结构蛋白在基因组的左侧，结构蛋白在基因组的右侧(5)。通过昆虫细胞重组表达的衣壳蛋白 VP2 可以自组装成病毒样颗粒（VLP）(6)，人们常用 VLP
图 1.2 HBoV 的二十面体结构。（A）（电子显微镜）用 4％乙酸双氧铀负染鼻咽样品中 HBoV的 EM 照片，放大倍数×60,000。（B）通过氯化铯超速离心从 bacVP2/HBoV 感染的 High-5细胞裂解物中纯化的 HBoV VP2（病毒样颗粒）VLP。纯化的 VP2 蛋白用 2％磷钨酸进行负染用于 EM 分析。（C）HBoV 衣壳结构。HBoV 表面表示低温重建的结构。HBoV 的分辨率为（7.9 ）。FIG 1.2 the structure of HBoV. (A) (electron microscopy) EM of HBoV in Nasopharyngealsamples after negative staining with 4% uranyl acetate, observed at ×60,000. (B) HBoV VP2(Virus-like Particles) VLPs purified from lysates of High-5 cells infected with bacVP2/HBoV bycesium chloride ultracentrifugation. Fractions containing VP2 proteins were prepared for EManalysis by negative staining with 2% phosphotungstic acid. (C) HBoV capsid structures. Stereo,radially color-cued, surface representation of HBoV cryo-reconstruction. HBoV are rendered atthe resolution (7.9 ).
【学位授予单位】：中国科学院武汉病毒研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373;Q78
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1 刘庆世;人博卡病毒（HBoV1）感染性克隆的构建及其NS1和NS1-70蛋白对NF-κB信号通路的调节[D];中国科学院武汉病毒研究所;2017年
本文编号：2524467
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