心脏生长和再生中心肌细胞的异质性

发布时间：2019-08-24 13:07

【摘要】：由于科学家对蝾螈的肢体再生能力兴趣,哺乳类和人类的心脏再生科学被密切研究了一百多年。直到最近,这门学科被认为如同科幻小说一般。再过去的二十年间,由于干细胞科学的极大创新以及其在心脏再生中的应用潜能,心脏再生医学得以复兴。最新的突破性报导惊人地展现出新生小鼠类心脏的再生活力。这个发现颠覆了传统的观念并指引临床应用新的希望。尽管如此,内源性心脏修复的机制并不明确。在这个课题中,我们研究了新生心肌在心脏生长和再生中的特性。我们工作首次揭示出新生心肌的异质性证据,即心脏中存在对心脏再生贡献大于其他心肌细胞的亚群。我们的研究同时提供了新的心肌再生研究焦点。传统观念认为出生后的心脏通过心肌细胞肥大得以生长。然而,我们的组织学结果和这个观点冲突。因为我们发现心脏组织的体积和心肌细胞的大小不成线性化的增长。通过BrdU介导的族系示踪,我们观察到约40%的青年心脏组织来源于原有心脏细胞的增殖。免疫荧光结果显示出新生心肌细胞表达细胞周期的标记物,拥有放射状的紧凑染色质并表现出旺盛的增殖活性。有趣的是,绝大多数的增殖的心肌细胞都表现出肌钙蛋白在细胞膜下定位的表型。这些细胞我们称为mT-CMs(细胞膜肌钙蛋白T定位的心肌细胞)。分子学证据表明mT-CM亚群的这种特殊表型并不是因为细胞有丝分裂过程中细胞骨架的解聚造成的。这些mT-C M细胞可能是有丝分裂过程中的普通心肌细胞,或者是一个介导新生新生肌发育的特殊亚群。前者的假设暗示着心肌细胞的增殖是一种随机事件。其结果导致心脏组织中散布的心肌细胞增殖。然而,BrdU派冲式细胞示踪结果显示新生发育心脏中存在小的心肌细胞群落。在单张组织切片层面上,这些群落通常由多于5个相邻细胞组成,而并不是散在的单个细胞。这个证据表明新生心脏中存在单个细胞来源心肌细胞群落。同时暗示,这些群落可能是由于某个新生心肌亚群的增殖。这个亚群和一般的心肌不同。我们认为可能是mT-CM亚群。为了进一步确认BrdU标记的肌细胞群落都分别来自单个心肌细胞,我们适用了时空可诱导的遗传学示踪技术。通过脉冲式的Tamoxifen处理,我们的系统足以灵敏到标记出单个体内细胞。单细胞示踪实验展现出了新生可增殖心肌细胞的克隆形成能力。通常,示踪的群落都有大于十个的心肌细胞组成。这些细胞都来自于原始的单个心肌细胞。令人吃惊的是,尽管青年时期的心脏对急性损伤的再生应答能力十分微弱,我们在青年的心脏组织中观察到了相同的现象。这些证据进一步暗示这一个特殊的心肌亚群,可能是]mT-CMs田胞,表现出了持续性的细胞增殖,并为心脏生成提供细胞资源。相比较普通的心肌细胞,mT-CM细胞同样表现出独有的分子特征。mT-CM细胞并不表达心脏祖细胞或者干细胞的标记物。这个结果表明mT-CM细胞不是干细胞向心肌细胞分化过程中的中间态细胞。细胞核蛋白免疫沉淀结果显示新生心室组织具有高丰度的细胞核内P-catenin蛋白。这个状态虽时间逐渐减弱。免疫荧光图像进一步确认细胞核内的(3-catenin信号特异地定位在mT-CM亚群中。然而,我们并没有观察到经典Wnt信号通路下游地靶基因表达。需要更多的证据用于阐明非经典Wnt信号通路在mT-CM细胞增殖中的作用。值得注意的是,mT-CM细胞特异表达胚胎期心脏发生关键基因GATA4。遗传学的证据进一步确认了这个观察。我们认为GATA4很可能是一个标记新生心肌中mT-CM亚群的分子标记物。功能学的证据进一步确认了mT-CM亚群在新生心肌细胞中的存在。心脏再生的分析结果显示nT-CM细胞较于一般心肌细胞拥有不同的心肌新生能力。通过长期的可诱导遗传族系示踪,我时间特异地标记出了新生增殖地心肌细胞(假定为mT-CM细胞)并且研究了其在心脏再生中的细胞行为和族系贡献。在心脏修复过程中,我们观察到一大部分标记的心肌细胞重新回到新生心肌的状态,表现出肌钙蛋白和骨架蛋白的细胞膜内定位的特点。相同的表现被其他的实验组在多种动物模型中报导过,并且由于和细胞分裂标记物表达的线性关系被认为是一种细胞增殖的特性。再则,在梗死心脏组织修改过程中,标记细胞的数量明显增加。有一部分细胞根据其规则的肌小结结构被鉴定为心肌细胞。尽管脉冲式的长时期细胞示踪无法标记出新生心脏中所以的增殖心肌细胞,统计学结果仍然惊人的显示标记的新生增殖心肌族系对新生心肌组织生成的巨大作用。这个证据证明了被标记的可增殖心肌细胞亚群和一般心肌比较,贡献给了心脏再生主要的细胞资源。总结,我们定性出了一个新的心肌细胞亚群。这个亚群向较于普通心肌细胞拥有更强的细胞增殖活性并且对心脏生长和再生起到重要作用。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q593

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