RTN3对CXCR4表达及原始生殖细胞迁移的影响

发布时间：2019-09-10 14:08

【摘要】：原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)是动物体内生殖细胞的前体细胞,其在生成之后会沿着特定的路径向生殖嵴进行迁移,并在到达生殖嵴后相继分化成雌性或雄性配子。在此过程中,PGCs准确到达生殖嵴是其最终分化成配子的前提条件之一。因此,迁移过程的准确性和精确性决定了PGCs的最终命运,也影响着机体的某些特定生理功能。动物体内PGCs的迁移异常会引起性原细胞的功能失调,影响机体的可育性,导致睾丸生殖细胞瘤等肿瘤的产生。PGCs在机体内的迁移过程受到趋化因子受体4(Chemokine receptor 4, CXCR4)等多种因子的联合调控。而在之前对于内质网蛋白3(Reticulon 3, RTN3)的功能研究又大多集中在细胞凋亡以及神经退行性疾病等方面。本研究在探究影响PGCs迁移的因子及其作用机制过程中,发现RTN3可能参与调控PGCs的迁移过程。首先通过酵母双杂交实验,我们发现了RTN3与CXCR4在酵母细胞中具有蛋白间的相互作用,在HEK293细胞中进行的免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, co-IP)实验也证实了两者间这一相互作用的存在。为了进一步分析影响这一蛋白相互作用的结构域信息,本研究通过构建RTN3结构域缺失载体并利用HEK293细胞进行co-IP分析,证明RTN3的C端保守结构域RHD是与CXCR4相互作用的重要功能区。为了进一步了解RTN3与CXCR4的作用关系,本研究首先通过荧光定量PCR和Western blot方法在HEK293细胞中检测了RTN3对CXCR4表达的影响。结果表明RTN3能够正调控CXCR4的表达,在过表达外源RTN3或敲低内源RTN3的情况下,内源CXCR4在mRNA水平和蛋白水平都会发生相应的上调或下调。随后在HeLa细胞进行的免疫荧光实验表明,RTN3还能够使CXCR4蛋白的亚细胞定位发生变化。正常状态下,CXCR4具有明显的细胞膜定位,并且分布较为均一,在RTN3过表达情况下,膜定位的CXCR4显著减少并发生了点状聚集,这些点状聚集与RTN3具有明显的共定位。这些结果暗示RTN3可能同时通过调控CXCR4的表达和亚细胞定位进而影响其某些生物学功能的行使。为了研究RTN3在PGCs迁移过程中的作用,本研究利用显微注射技术在斑马鱼胚胎中过表达了RTN3和CXCR4b,并观察其对PGCs迁移的影响。结果表明,RTN3过表达能够显著影响斑马鱼PGCs的迁移,使PGCs概率性的出现在生殖嵴以外的随机位置,说明在RTN3过表达情况下斑马鱼的PGCs迁移过程受到干扰,从而出现了迁移异位。这些表型与在斑马鱼胚胎中过表达CXCR4b的表型非常相似。综上所述,本研究分别以酵母菌、哺乳动物细胞(HEK293和HeLa细胞)以及斑马鱼模式生物为研究材料,揭示了RTN3与CXCR4的作用关系和调控方式,验证了RTN3在调控斑马鱼PGCs迁移过程中的重要作用。这些结果为进一步了解RTN3的生物学功能及其对PGCs迁移调控机制的研究提供了理论依据。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q492

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