大肠杆菌在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面的粘附与生长特性

发布时间：2019-09-24 04:46

【摘要】：食品、医疗领域中的设备、器械、材料等固体表面在使用过程中易被细菌粘附而形成菌膜。被菌膜污染的表面会造成与之接触的食品腐坏、生物组织感染,严重威胁消费者与患者的健康。菌膜成熟后难以被清除,因此,为了减少菌膜的污染,就需对菌膜成熟之前的阶段(即细菌在表面上的粘附与生长阶段)进行深入研究。目前,针对控制细菌粘附的方法多为在表面上键合消毒剂基团、抗生素分子等化学方法。然而上述方法具有风险,如:消毒剂具有很强的细胞毒性、抗生素促使细菌产生耐药性等,使得化学方法抑制细菌粘附在食品、医疗领域中的应用受到了极大的限制。因此,在表面上构建三维规则微观形貌的物理方法成为了当前的研究热点。但是,细菌在规则形貌上的粘附方式尚不清楚;针对细菌粘附后的增殖生长过程研究也较为匮乏,相关的生长动力学、菌体的细胞行为等尚无明确报道。本文选取食品、医疗工业中常用的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)材料作为研究基底,以大肠杆菌作为受试菌株,首先建立合适的表面形貌物理改造方法,在PET基底上构建具有多图案元素、尺寸梯度的三维规则结构,并系统研究不同培养条件下三维形貌对细菌粘附的影响,明确细菌对规则结构的粘附响应方式;针对菌体的生长阶段,从生物物理角度详尽考察粘附后的菌体在PET平坦表面上的生长动力学、分裂与细胞尺寸控制机理、各生长时期菌体的表现行为以及菌体与基底表面之间的相互作用,并明确菌毛对菌体粘附及生长过程的作用。论文的主要研究内容包括:(1)PET表面规则微观形貌的构建及其对大肠杆菌粘附过程的影响采用紫外线光刻技术+热压印法:将AutoCAD软件中设计的二维图案通过紫外线光刻技术转移到硅片主模上形成三维规则结构,再分别通过聚二甲硅氧烷(PDMS)软印章、环氧树脂进行两次三维结构传递以制作热压硬模具,最后应用热压印法在PET表面上构建出三维规则微观形貌。采用扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)对传递后的微观形貌进行观察,结果发现:PET表面上形成了良好的微米级(1-8?m)三维结构。采用红外光谱(IR)、接触角测定仪测定热压处理前后PET表面分子结构、疏水性质的变化,结果显示PET表面的分子结构、疏水性质在热压前后没有发生显著变化。采用上述方法,在PET表面上构建出同时包含弯曲边缘、直边缘、凸出柱体平面以及柱体之间的凹谷平面的三维规则形貌,并有六个尺寸梯度。采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)、SEM手段分别考察寡/富营养、静/动态培养环境下,大肠杆菌在规则微观形貌上的粘附数量、在各图案元素上的分布情况。结果发现:菌体可以感知PET表面的微观形貌:对三维结构曲率小的边缘地带表现出明显的偏好性粘附;曲率大的区域在初期可以抑制大肠杆菌的粘附,但长期培养后,菌体可以克服不利的物理地形;细菌对各图案元素粘附时表现出的偏好性越小,菌体在该三维规则微观形貌的粘附数量越少。并且,菌体对微观形貌的感知能力与培养环境有关,环境中营养较少并存在流体剪切应力时,菌体会失去对微观形貌的感知能力。(2)大肠杆菌在PET表面的生长与细胞尺寸控制方式采用CLSM测定粘附后的大肠杆菌在PET表面上分裂增殖形成微菌落的过程。结果发现:附着在表面上的菌体的生长动力学曲线表现出与传统生长曲线相似的“延滞期”、“对数期”。子代细胞的倍增时间为38 min,而相同培养条件下,游离在培养液中的大肠杆菌的倍增时间为16 min。同时,首次发现并证实大肠杆菌在表面上的生长过程中,微菌落形态、细胞尺寸均由群体效应方式控制。(3)I型菌毛对大肠杆菌在PET表面上粘附和生长的影响构建无I型菌毛的大肠杆菌突变菌,采用CLSM考察I型菌毛对大肠杆菌可逆性粘附、不可逆性粘附以及增殖生长过程的影响。结果发现:I型菌毛对可逆性粘附过程影响不显著,对不可逆吸附阶段影响显著。无菌毛的突变菌无法进入不可逆吸附阶段,也无法在PET表面上进行增殖生长。(4)粘附和生长过程中表面大肠杆菌对剪切应力的响应将往复振动装置产生的流体剪切应力,作用于在PET表面上处于粘附或增殖生长过程的大肠杆菌。采用CLSM考察处理后菌体在表面上的存留数量以及死活状态,进而了解粘附、生长过程中菌体与基底表面的相互作用力的变化,并探究群体效应对表面上生长的野生型大肠杆菌对剪切应力的响应变化。结果显示:存留比例以及菌体对表面粘附力的大小排序均为“延滞期”“单层微菌落”时期“多层微菌落”时期,存留比例只与菌体所处生长状态有关,与培养时间、菌落大小无关;菌体活细胞比例与微菌落大小有关,而与菌体所处生长状态无关;群体效应得到抑制后,微菌落中细菌抵抗外界流体剪切应力的能力降低。
【图文】：

微观形貌,粘附,三维图,平面

第二章 PET 表面规则微观形貌的构建及其对大肠杆菌粘附过程的影响在富营养环境中，活、死菌体在动态培养条件下的粘附数量均多于静态培养条件下的粘附数量（图 2-8（a））。静态培养时，在 PET 基底上观察不到死亡菌体的粘附，只有活细胞可以粘附在表面上；而死亡菌体在动态培养条件下时，即菌体悬浮液对表面有较小的剪切应力作用时，却可以粘附到表面上。如图 2-8（a）所示，死细胞粘附数量最少的是平坦对照表面，图 2-8（b）显示出，活、死菌体比例相差最大的也是平坦对照表面，这说明在动态培养条件下，三维结构的存在更有助于死亡菌体的粘附。值得注意的是，从图 2-8（a）中观察到，无论是静态还是动态培养，活菌的数量随图案编号 1-6 的变化趋势相同。

振动装置

图 5-1 往复直线振动装置Fig. 5-1 The device of reciprocating linear vibration 扫描图像处理及数据分析AS AF lite 软件输出两个光电倍增管频道得到的扫描图片，然后NIH, Bethesda, Maryland, http://rsbweb.nih.gov/ij/）处理图像，并据点平行重复实验三次（包括生长培养、剪切应力的作用），单A）由 Microsoft Excel 计算，文中数据为平均值±标准方差。与讨论实际中，表面清洗剂清洗设备、管路时，表面细菌有时不能很要流体剪切力的辅助[172]。菌体去除的动力学与液体清洁剂的流数有关[173, 174]。在现有关于剪切应力对菌体的影响相关文献报道行板流动室（parallel plate flow chamber），，此装置可随实验需要用显微镜可在线观察细胞粘附、脱离或菌膜生长状况[164, 170, 175]。材料表面菌体的影响均是在单一方向流速条件下进行，针对多方
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93

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