脂环酸芽孢杆菌产愈创木酚代谢途径解析及检测控制方法研究

发布时间：2019-09-25 14:35

【摘要】：脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)具有嗜酸耐热性,是果汁工业中关键的质量安全因子,受到了果汁生产厂家和科研工作者的广泛关注。脂环酸芽孢杆菌的代谢产物——愈创木酚产生一种类似于苯酚类化合物的“药味”和“消毒水味”,含量很低时即可给果汁带来不愉快的气味。因此,本研究以愈创木酚的产生为主线,筛查了脂环酸芽孢杆菌产愈创木酚的前体物,解析了脂环酸芽孢杆菌利用香草酸和香草醛产生愈创木酚的代谢途径,同时研究了愈创木酚生成过程中的关键酶——香草酸脱羧酶的基本性质及编码基因,在此基础上,构建了苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的检测和控制方法体系。主要研究内容和结果如下:(1)对脂环酸芽孢杆菌产愈创木酚的前体物进行了筛查,通过生长细胞、静息细胞及细胞破碎等手段并结合HPLC和LC-MS检测技术对中间代谢产物及相关酶进行了解析。研究结果表明:A.acidoterrestris可以利用香草酸和香草醛产生愈创木酚,但不能代谢儿茶酚、阿魏酸、酪氨酸和苯丙氨酸生成。在NAD(P)+依赖的香草醛脱氢酶的作用下,A.acidoterrestris(DSM 3923)先将香草醛氧化成香草酸,再通过香草酸脱羧酶的非氧化脱羧反应生成愈创木酚,同时还有小部分的香草醛被NADPH依赖的香草醛还原酶转化为香草醇。A.acidoterrestris(DSM 3923)中的香草酸脱羧酶是非氧气敏感性的,催化反应不需要辅助因子吡啶核苷酸,并且是可逆的,但脱羧效率要远远大于羧化效率,ATP的添加对羧化作用无显著影响。(2)研究了A.acidoterrestris(DSM 3923)生长过程中香草酸脱羧酶的活性变化,对比分析了超声波、溶菌酶、细胞裂解液和甲苯渗透法对A.acidoterrestris(DSM 3923)细胞中香草酸脱羧酶的提取效果,优化建立了最佳的提取方法,并评价了不同因素对酶活性的影响。结果表明:香草酸脱羧酶在对数生长初期的比活力最大(3.23 U/mg),随着生长的进行比活力迅速下降。在超声功率330 W、破碎总时间12 min、超声间歇时间1 s/5 s、菌体质量浓度0.38 mg/mL条件下,提取获得的香草酸脱羧酶活力最高(7.68U/mg)。同时,香草酸脱羧酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH值为6.0-6.5;Co2+和Mn2+对香草酸脱羧酶的活性有一定的促进作用,Na+、K+、Li+、Mg2+和Fe2+对其活性无显著影响,而Ni2+、Cu2+、Ba2+、Fe2+有强烈的抑制作用;当添加浓度为1 mmol/L时,肉桂酸、阿魏酸、白藜芦醇、槲皮素和芦丁可以完全抑制酶的活性。(3)对A.acidoterrestris(DSM 3923)中香草酸脱羧酶的编码基因(vdc)进行了扩增、测序及序列分析,结果发现:A.acidoterrestris中vdc基因全长3309 bp,包含vdcA、vdcB、vdcC和vdcD四个基因。vdcA的全长为894 bp,其蛋白为LysR家族的转录调控子;vdcB、vdcC和vdcD的长度分别为597、1425和231 bp,推测编码的蛋白质分别为酚酸脱羧酶B、C和D亚基。考察了脂环酸芽孢杆菌愈创木酚产生能力与vdcC基因的相关性,结果在愈创木酚产生菌中均扩增发现了vdcC基因,而非产生菌中均未扩增到。对vdcC基因进行测序,发现A.acidoterrestris、A.herbarius和A.acidiphilus种间部分vdcC基因序列的相似性为87.3%,而A.acidoterrestris和A.herbarius种内的相似性分别为99.5%和99.1%,说明vdcC基因在同一种内具有很高的保守性,为以vdcC基因序列为基础在种的水平上进行脂环酸芽孢杆菌愈创木酚产生菌的检测提供了依据。(4)采用Clustal X软件分析了不同物种vdcC基因的同源性,并用Primer Premier 6.0设计获得了特异性引物,建立了苹果汁中A.acidoterrestris的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,研究结果表明:基于vdcC基因的Real-time PCR体系对A.acidoterrestris有较好的特异性,检测灵敏度为2.6×101 CFU/mL;对苹果汁加标样品进行检测时,其扩增效率为105.86%,标准曲线R2=0.987。同时,构建了苹果汁样品中A.acidoterrestris含量与其代谢产物愈创木酚浓度之间的对应关系,所得拟合曲线的相关性良好,R2=0.833,为苹果汁中A.acidoterrestris和愈创木酚的同时快速检测提高了思路和方法。(5)考察了二氧化氯单独处理或与超声波及振荡联合处理对苹果表面A.acidoterrestris芽孢的去除作用,结果表明:二氧化氯耦合振荡法的去除效果最好,当二氧化氯添加浓度为200 mg/L、振荡频率为200 rpm时,处理20 min,可以全部杀灭苹果表面的芽孢。同时探究了pH值对芽孢去除效果的影响,结果发现:酸性条件有利于二氧化氯对A.acidoterrestris芽孢的杀灭,而碱性条件更利于芽孢与苹果表面的分离。在振荡条件下(200 rpm),以质量浓度为50 mg/L的二氧化氯(pH=2.5)对人工污染有3、4和5 log10 CFU/苹果的样品分别处理5、10和20 min,可以将苹果表面的A.acidoterrestris芽孢全部去除,为A.acidoterrestris的源头控制提供了技术参数。(6)探究了果汁中常用防腐剂对A.acidoterrestris生长及愈创木酚产生的影响,结果表明:脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸和肉桂酸可以有效控制A.acidoterrestris的生长及愈创木酚的产生。在苹果汁中分别添加270 mg/L脱氢乙酸、108 mg/L肉桂酸或100 mg/Lε-聚赖氨酸,培养2周后,A.acidoterrestris的菌落数分别降低了3.43、3.17和4.78 log10CFU/mL,并且在果汁样品中未检测到愈创木酚的产生。感官评价的结果显示这些物质的添加对苹果汁的感官品质和可接受性无显著性影响,为果汁终产品中脂环酸芽孢杆菌的有效控制提供了依据和方法。
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图 1-1 脂环酸芽孢杆菌属不同菌株 16S rRNA 基因序列的系统发育树（Nakano et al. 2015）Figure 1-1 Phylogenetic distance tree derived from comparison of the 16S rRNA gene sequences ofdifferent Alicyclobacillus species.1.2 主要特征脂环酸芽孢杆菌的特性主要包括三方面：基本的细胞形态特征、细胞膜的主要脂

孢杆菌的代谢产物主要包括愈创木酚和卤酚两类恶臭物质，溴苯酚和 2,6-二氯苯酚，它们的化学结构式如图 1-2 所示，，愈创木酚是最主要也是关注最多的污染物；同时，在一些污二溴苯酚、2,4-二氯苯酚和 2,4,6-三氯苯酚等化学物质（ChSmit et al. 2011；Steyn et al. 2011）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3


本文编号：2541496