Shewanella oneidensis呼吸作用对生物被膜形成的影响及其分子基础研究

发布时间：2017-03-18 14:10

  本文关键词：Shewanella oneidensis呼吸作用对生物被膜形成的影响及其分子基础研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自然环境中,细菌能以多种方式生存并通过响应周围不断变化的环境条件,改变其原有的生活方式。当细菌群体的细胞浓度较高时,细菌可以在非生物或者活性表面形成固体生物被膜(solid-surface associated biofilm, biofilm),也能聚集在气液分界面形成气液生物被膜(air-liquid interface biofilm, pellicle)。细菌生物被膜的形成由一系列复杂的生物化学过程组成,并受到环境因素的影响和调控。本课题的研究对象Shewanella oneidensis是一种革兰氏阴性的兼性厌氧菌,能够利用一系列无机物和有机物作为电子受体进行呼吸并广泛分布于各种自然环境中。之前关于S. oneidensis的研究中,在培养基中加入金属螫合剂EDTA能够显著降低其气液生物被膜的生物量,并且生物被膜的形成在EDTA浓度为0.3mM时完全被抑制,该现象表明二价金属阳离子在气液生物被膜的成熟中起到重要作用。本研究中,我们以二价阳离子对气液生物被膜的影响为切入点,将S.oneidensis菌株培养于添加了不同二价金属阳离子的24孔板内,随后观察记录气液生物被膜的形成情况,发现二价铁离子对气液生物被膜的形成具有特殊的影响。研究结果表明,少量的Fe2+对于气液生物被膜的形成是必要的,而过量的铁离子(0.3 mM Fe2+或Fe3+)会导致气液生物被膜的解体,但并不影响细菌的有氧生长。通过一系列的实验我们进一步证明,铁离子对气液生物被膜的破坏是由于在该培养条件下,S. oneidensis介导了不可溶电子受体铁氧化合物(Fe3O4、Fe2O3等)的形成。当含Fe3+的铁氧化合物形成时,部分有能力形成气液生物被膜的细菌倾向于在不可溶电子受体表面形成固体生物被膜,并且优先利用该电子受体进行呼吸。本课题深入探讨了铁对S. oneidensis气液生物被膜产生的影响,表明其特殊的呼吸机制决定了它对于不同呼吸底物的选择,以及由此产生的生存方式的转变。由于之前的研究已经对S. oneidensis的无氧呼吸做了较为深入的探讨,因此本课题以上述结论作为出发点,着眼于有氧呼吸和微氧呼吸中所涉及的末端氧化酶,对S. oneidensis独特的呼吸系统和呼吸调控机制进行了深入研究。与大多数细菌类似,S. oneidensis拥有多种终端氧化酶,包括两个血红素-铜氧化酶(caa3型和cbb3型)和一个bd型醌醇氧化酶。S. oneidensis能够在富含层化电动势化合物的环境中生存,其中的分子机理是本研究将要探讨的另一个重要问题。研究中我们发现cbb3型细胞色素氧化酶在有氧呼吸中占主导地位；而微氧条件下,除cbb3型细胞色素氧化酶之外,bd型醌醇氧化酶也起到重要作用。与此相反,与线粒体氧化酶同源的caa3型细胞色素氧化酶表达量极低,使它在S. oneidensis中几乎不发挥作用。此外,cbb3型细胞色素氧化酶和bd型醌醇氧化酶的表达受Crp (cAMP受体蛋白)的调控。这些发现表明,S. oneidensis对不同氧化还原环境的适应性来自呼吸调控系统的转换以及caa3型细胞色素氧化酶的功能缺失。综上所述,本研究以二价金属离子对S. oneidensis气液界面生物被膜的影响为出发点,探讨了S. oneidensis独特的呼吸系统对电子受体选择以及生存方式转变过程的影响,并且对其独特的终端氧化酶体系以及呼吸调控系统进行了深入研究。
【关键词】：Shewanella oneidensis 气液生物被膜 细胞色素末端氧化酶 呼吸调控系统 Crp蛋白
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 绪论14-29
• 1.1 细菌生物被膜概述14-19
• 1.1.1 细菌生物被膜的结构特征14-17
• 1.1.2 细菌生物被膜的生长周期17-19
• 1.2 气液生物被膜中的金属离子19-20
• 1.3 S. oneidensis的末端氧化酶及其调控系统20-26
• 1.3.1 细胞色素氧化酶概述21
• 1.3.2 细菌中的末端氧化酶21-25
• 1.3.3 S. oneidensis的末端氧化酶25-26
• 1.4 本研究的背景、主要内容及意义26-29
• 2 二价金属阳离子对S. oneidensis气液生物被膜的影响29-56
• 2.1 材料与方法29-35
• 2.1.1 化学药品和试剂29-31
• 2.1.2 供试菌株、质粒以及培养条件31-32
• 2.1.3 框内缺失突变株的构建与回补32-33
• 2.1.4 气液生物被膜的培养及生物量的测定33
• 2.1.5 β-半乳糖苷酶活性检测33-34
• 2.1.6 通过Ferrozine试验测定铁的氧化物中Fe~(2+)和Fe~(3+)的比例34-35
• 2.2 结果与分析35-51
• 2.2.1 S. oneidensis气液生物被膜的形成需要二价金属阳离子35-39
• 2.2.2 Mg~(2+)和Fe~(2+)对于气液生物被膜的形成是必要的39-43
• 2.2.3 Fe~(2+)的氧化对气液生物被膜形成的影响43-46
• 2.2.4 不可溶电子受体能够破坏S. oneidensis的气液生物被膜46-50
• 2.2.5 铁离子对△cymA和△crp的气液生物被膜没有影响50-51
• 2.3 讨论51-56
• 2.3.1 Fe~(2+)对S. oneidensis气液生物被膜的影响52-53
• 2.3.2 铁氧化合物的形成能够破坏S. oneidensis气液生物被膜53-54
• 2.3.3 S. oneidensis倾向于在不可溶电子受体表面形成固体生物被膜54-56
• 3 c型细胞色素在有氧呼吸中起到关键作用56-72
• 3.1 材料与方法56-61
• 3.1.1 供试菌株、质粒以及培养条件56-57
• 3.1.2 框内缺失突变株的构建与回补57-58
• 3.1.3 S. oneidensis有氧培养及生长速率测定58
• 3.1.4 Nadi试验58-59
• 3.1.5 生理特性研究59
• 3.1.6 存活率试验59
• 3.1.7 启动子活性检测59-60
• 3.1.8 qRT-PCR60-61
• 3.2 结果与分析61-69
• 3.2.1 细胞色素c蛋白在有氧生长中的重要作用61-63
• 3.2.2 细胞色素cbb_3氧化酶在S. oneidensis的有氧呼吸中至关重要63-65
• 3.2.3 细胞色素cbb_3氧化酶和细胞色素bd氧化酶在微氧呼吸中起到关键作用65-66
• 3.2.4 S. oneidensis末端氧化酶在呼吸中的功能与表达水平有关66-68
• 3.2.5 cyd操纵子的补偿表达68-69
• 3.3 讨论69-72
• 3.3.1 S. oneidensis在有氧条件下主要利用cbb_3型氧化酶进行呼吸69-70
• 3.3.2 S. oneidensis中细胞色素caa_3氧化酶功能丧失70-72
• 4 S. oneidensis呼吸系统的调控72-81
• 4.1 材料与方法72-74
• 4.1.1 供试菌株、质粒以及培养条件72-73
• 4.1.2 启动子活性检测73
• 4.1.3 Crp-His融合蛋白的表达纯化73-74
• 4.1.4 EMSA试验74
• 4.2 结果与分析74-78
• 4.2.1 全局调控因子ArcA,Crp和Fnr对cco,cox以及cyd操纵子表达的影响74-76
• 4.2.2 Crp蛋白的DNA结合特征76-78
• 4.3 讨论78-81
• 5 论文总结81-85
• 5.1 主要研究结论81-83
• 5.2 创新之处83
• 5.3 不足及展望83-85
• 参考文献85-98
• 附录98-101
• 致谢101-103
• 作者简介103-104

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