苜蓿中华根瘤菌PrkA蛋白激酶活性的验证及其磷酸蛋白组学研究

发布时间：2017-03-18 13:05

  本文关键词：苜蓿中华根瘤菌PrkA蛋白激酶活性的验证及其磷酸蛋白组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：苜蓿中华根瘤菌能够通过调控其细胞活动来应对土壤环境中的营养胁迫和多种逆境压力,并有效的同豆科植物苜蓿之间建立共生互作关系。原核生物中分布非常广泛的PrkA蛋白激酶在多种逆境条件下在生长的稳定期能够被大量诱导表达,但是到目前为止,还没有找到prkA缺失突变体的显著表型。鉴于PrkA蛋白是一个潜在的原核生物丝氨酸蛋白激酶,本研究对苜蓿中华根瘤菌的PrkA蛋白序列进行克隆,过表达和纯化。利用PCR反应扩增得到了PrkA的蛋白表达序列,将克隆得到的蛋白表达序列插入蛋白表达载体pET-28a (+)中,受噬菌体T7启动子和lac操纵子的转录调控,然后直接转化到E. coli BL21 (DE3)菌株中,经过诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳检测到了一个大小约75 kDa的蛋白,这同PrkA预测到的大小值74.2 kDa比较接近。同时,还纯化了缺失AAAdomain的PrkA蛋白,并且在体外条件下,对PrkA以及ΔAAA_PrkA蛋白的自我磷酸化以及对酪蛋白的底物磷酸化活性进行了验证。结果表明,二价阳离子对其激酶活性呈现了不同的诱导作用,其中,Mn2+促进PrkA的激酶活性,并且在2 mM浓度下催化活性达到最大,而Mg2+对其催化活性有一定的抑制作用。同时还发现AAA domain对其催化活性是必需的。为了进一步了解Sinorhizobium meliloti和PrkA蛋白激酶相关的磷酸蛋白图谱,利用Ti02富集手段结合LC-MS/MS技术分析了稳定期(OD600=1.886)在12mMP(基本培养基含有12 mM无机磷)培养条件下Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 WT和ΔprkA突变体的磷酸蛋白组图谱,在这个条件下一共检测到了154个特异性磷酸化位点(Ser:Thr:Tyr=97:51:6),相应的磷酸化肽段为142个,一共检测到了123个磷酸化蛋白。其中WT和ΔprkA突变体特异性磷酸蛋白分别为45和40,还有38个磷酸化蛋白是两者共有的,但是这些蛋白的磷酸化位点并不都是保守的。检测到的磷酸化蛋白广泛地分布于多种生物学过程,细胞功能,细胞组分以及分子功能。通过分析WT和ΔprkA突变体磷酸蛋白组学研究鉴定到的差异化信号有可能帮助了解和PrkA激酶相关的磷酸化事件。Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 WT和AprkA突变体在2mMP (OD600=0.889)条件下,发现两者的混合竞争能力存在显著性的差异,为此我们还进一步分析了2mMP条件下的WT和ΔprkA突变体的磷酸蛋白图谱,分别检测到了8个(ΔprkA突变体)和12个(WT)磷酸化蛋白信号。这是我们第一次利用磷酸蛋白组学技术分析S. meliloti的磷酸蛋白组图谱,并对不同条件下检测到的磷酸化蛋白以及磷酸化位点的差异信号进行了讨论。
【关键词】：PrkA 蛋白磷酸化 胁迫反应 苜蓿中华根瘤菌 磷酸蛋白组学
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q939.114
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 缩略词一览表10-12
• 第一章 绪论12-39
• 1.1 引言12-13
• 1.2 根瘤菌和豆科植物高效共生固氮体系的建立13-16
• 1.3 豆科植物和根瘤菌分子对话机制的研究概况16-18
• 1.4 根瘤菌和豆科植物在根圈的互作以及根圈微生物适应环境的机制18-27
• 1.5 蛋白磷酸化在研究细菌抗逆机制中的研究概况27-31
• 1.6 磷酸蛋白组学技术在研究细菌抗逆机制中的进展31-36
• 1.7 本研究的目的和意义36-39
• 第二章 材料与方法39-64
• 2.1 实验材料39-42
• 2.1.1 菌株和载体39
• 2.1.2 培养基39-40
• 2.1.3 实验试剂40-42
• 2.2 实验方法42-64
• 2.2.1 根瘤菌的分离纯化和保存42
• 2.2.2 表型分析实验42
• 2.2.3 磷含量的检测42-43
• 2.2.4 PrkA以及△AAA_PrkA蛋白表达载体的构建,表达和纯化43-49
• 2.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳检测以及BCA法检测蛋白的浓度49-50
• 2.2.6 PrkA和△AAA_PrkA蛋白的体外磷酸化50-51
• 2.2.7 亲和层析寻找蛋白激酶PrkA潜在的靶蛋白51-53
• 2.2.8 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290基因组测序,组装和注释53-58
• 2.2.9 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290的磷酸蛋白组学研究58-62
• 2.2.10 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290的磷酸蛋白组学研究的数据处理和生物信息学分析62-64
• 第三章 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 PrkA蛋白激酶活性的验证64-77
• 3.1 引言64-67
• 3.2 结果与分析67-75
• 3.2.1 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290 WT和△prkA突变体在逆境胁迫条件下的竞争实验67-69
• 3.2.2 磷含量的检测结果69-71
• 3.2.3 PrkA以及△AAA PrkA蛋白的表达和纯化71-73
• 3.2.4 PrkA以及△AAA PrkA蛋白的体外磷酸化实验结果73-75
• 3.3 结论75-77
• 第四章 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290的磷酸蛋白组学研究77-109
• 4.1 引言77
• 4.2 结论与分析77-107
• 4.2.1 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290基因组DNA样品的准备和确认77-78
• 4.2.2 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290基因组的组装和注释78-80
• 4.2.3 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290磷酸蛋白组学研究的蛋白样品的准备和验证80-81
• 4.2.4 Sinorhizobium meliloti CCBAU01290磷酸蛋白组学研究的数据处理和生物信息学分析81-107
• 4.3 结论107-109
• 第五章 结论与展望109-112
• 5.1 结论109
• 5.2 展望109-112
• 参考文献112-133
• 附录133-147
• 致谢147-148
• 个人简历148

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本文编号：254481