集胞藻PCC 6803中组氨酸激酶Hik33功能蛋白质组学研究

发布时间：2019-10-17 11:53

【摘要】：蓝藻广泛分布在地球上几乎所有的陆地和水生栖息地,在长期进化过程中蓝藻形成了一套灵敏且高效的环境信号感知及应答调控系统,以应对长期进化过程中不断变化的不利环境条件。众所周知,二元信号转导系统(TCS)是原核生物中主要信号转导系统,TCS在蓝藻感知环境变化并将其转化为细胞内信号的过程中发挥着重要作用,TCS感知环境信号并进一步调控细胞内相应蛋白的差异表达,最终实现细胞对环境的适应。典型的TCS通常由负责信号感知的组氨酸激酶(Hik)和负责基因调控的响应调节因子(Rre)构成。自然生长条件下的蓝藻经常需要面对各类环境胁迫条件,如高光胁迫、氧化胁迫、低温胁迫、盐胁迫、渗透压胁迫等。组氨酸激酶Hik33在蓝藻响应各种环境胁迫条件的过程中发挥着极其重要的作用。Hik33在蓝藻中高度保守且在其它原核生物中同源性很低,这预示着Hik33在协调光合作用和应激反应过程中起着不可替代的作用。虽然大量研究已表明Hik33在蓝藻应急调控中发挥着重要的作用,但Hik33如何感受环境信号并进一步调控蓝藻细胞做出相应应答反应在很大程度上仍然未知。系统性研究Hik33依赖的差异基因的表达可以为研究Hik33在应急反应中的作用提供重要信息。但目前已知的信息仅停留在转录水平,且大多数研究仅局限于单一胁迫条件。由于转录水平往往与蛋白质水平缺乏较好的一致性,且Hik33在多种胁迫条件下均发挥着重要的调控作用,因此单一的转录水平信息远远无法满足Hik33作为全局性胁迫调控因子发挥作用的机理分析。本论文研究中,我们以大规模定量蛋白质组学的方法在细胞不同的营养方式和不同碳源可获得性条件下研究了集胞藻Hik33缺失突变体中不同功能蛋白的差异表达变化情况。1.Hik33调控通用型应激响应(CommonStress-ResponsiveCSR)蛋白的差异表达实现对集胞藻6803环境压力应答的调控。通过使用定量蛋白质组学方法和生物信息学分析手段,我们发现Hik33的敲除显著影响了集胞藻6803中208个蛋白下调和369个蛋白质上调。在这些变化显著的蛋白中还包含了 60个通用型应激响应(Common Stress-Responsive CSR)蛋白。在下调的蛋白中,最显著的功能富集分类是光合作用,特别是光系统Ⅰ和藻胆体蛋白,此类功能蛋白可提供细胞生长所需的碳源和能量,因此对集胞藻的生长和增殖是至关重要的。这些功能蛋白的下调表明,Hik33突变体或应激条件下的野生型细胞需要分别通过牺牲生长或增值水平来应对由Hik33敲除或应激引起的细胞内部的不良反应。相比之下,许多热休克蛋白、伴侣蛋白、蛋白酶蛋白和参与细胞内氧化还原状态调节的蛋白都因Hik33的敲除或胁迫应激而上调。蛋白质变性发生在几乎所有胁迫应激条件下,并导致变性蛋白质在胞质溶胶中的积累,这些变性蛋白的积累会进一步引发胁迫反应。热休克蛋白、伴侣蛋白和蛋白酶蛋白,如HspA、HtpG、GroEL1、DnaJ和ClpC的上调对于修复这种损伤是必要的,对于细胞存活也是必须的。此外,胁迫条件和Hik33的缺失也可能诱导细胞内氧化还原状态的改变和ROS的产生。因此,参与氧化还原调节和ROS清除的蛋白,包括MrgA(Slr1894)、过氧化物酶 S110755 和 Slr0242、Gpx1 (Slr1711)和 Gpx2 (Slr1922)、SodB、KatF (S111987)和Tpx (S07575)也同样上调。最后,在胁迫条件或Hik33突变体中,光系统Ⅱ的损伤也将导致应激反应,这需要更多的蛋白质,如FtsH和OCP进行保护和修复。综上所述,上调蛋白质的功能虽然各异,但对于保护蓝藻免受胁迫条件或Hik33敲除引起的损伤都是至关重要的。因此,我们认为,对于增殖和生存的协调可能是蓝藻在环境压力条件下经长期进化而演变出的生存策略,而Hik33则可能是这一生存策略的具体实施和关键调控因子。这也更加凸显了 Hik33作为集胞藻6803中全局性调控因子的重要地位。2. △Hik33通过上调OPP途径获得更高效的葡萄糖利用率生长表型研究发现,当培养基中额外添加葡萄糖时可显著恢复Hik33突变体生长。为了进一步探究Hik33缺失诱导的应激反应是否是由于碳素缺乏导致,以及光抑制条件下蓝藻细胞如何利用有机碳源。我们在培养过程中额外补充葡萄糖(5% ),定量比较该培养条件下Hik33突变体与野生型细胞蛋白质组水平的差异,进一步探究了 Hik33突变体对有机碳源的同化策略。根据蓝细菌光合活性的水平,葡萄糖可以通过不同的途径被分解代谢。当光合作用被抑制时,例如在黑暗中或在PET抑制剂的存在下,如DCMU,外源葡萄糖主要通过可产生NADPH的戊糖磷酸途径(Oxidative Pentose Phosphate,OPP)途径分解代谢。当光合作用被激活时,如在光照条件下或不存在PET抑制剂的情况,外源葡萄糖主要通过糖酵解的上游部分和卡尔文循环(Calvincycle)途径代谢。然而,葡萄糖在受到部分光抑制的野生型细胞或Hik33敲除突变体细胞中是如何被降解利用的,目前为止对于该领域的研究还并不清楚。为了揭示Hik33突变体快速光合混合营养生长的蛋白质组学基础,我们比较了 Hik33突变体和野生型细胞之间在正常和额外添加葡萄糖培养条件下,与碳代谢相关蛋白的差异表达情况。通过蛋白质组学数据的分析,我们发现,所有涉及NADPH产生的OPP通路中的关键酶蛋白,如Zwf、OpcA、Gnd和Pgl等,与野生型细胞相比该类蛋白表达量水平都由在正常培养条件下的显著或微量下调变成了在外加葡萄糖培养条件下的显著或微量上调,这也预示着Hik33突变体可能获得了额外的利用葡萄糖的能力。事实上,在光激活的异养生长(Light-Activated Heterotrophic Growth,LAHG)条件下培养时,此时葡萄糖是唯一的碳源和能源,而且葡萄糖只能通过OPP途径降解,在该条件下Hik33突变体生长速率较野生型细胞有一定幅度的上升。这一结果进一步表明,Hik33突变体通过上调OPP途径获得了较高的葡萄糖利用效率。值得注意的是,在LAHG条件下,突变体的叶绿素含量仍然低于野生型细胞,这表明在LAHG条件下Hik33缺失诱导的应激反应并没有被消除。总之,以上结果均表明,Hik33敲除突变体可以更好的利用葡萄糖,而且最有可能通过上调OPP途径的关键酶蛋白来实现这一目的,但与此同时,由于Hik33本身缺失引发的细胞内应激反应并没有消除。基于蛋白质组学和表型实验结果,我们提出了一个模型来解释在光合混合营养生长条件下葡萄糖在Hik33缺失突变体中分解代谢的途径。在野生型细胞中,正如前人使用13C标记的葡萄糖进行的代谢通量分析实验结果所示,经过OPP途径代谢的碳流量几乎可以忽略不计。然而,在Hik33突变体细胞中,OPP变成了葡萄糖降解利用的主要途径,或者至少部分提供了用于C02同化的NADPH和RuBP。3. △Hik33通过调控PetE和PetJ的差异性表达实现高浓度C02培养条件下快速生长在培养Hik33缺失突变体时发现,向培养液中额外补充5%浓度的CO2气体,可显著提高Hik33突变体的生长。为了探究hik33缺失突变体在光合受损及NADPH供应量不足的情况下CO2的固定策略,我们在培养过程中额外补充过量CO2 (5%),定量比较该培养条件下Hik33突变体与野生型细胞蛋白质组水平的差异,以期揭示蓝藻在光系统受损情况下(如Hik33突变体)NADPH供应及C02同化策略。与在正常培养条件下Hik33突变体和野生型细胞的蛋白质组学数据相比较,高浓度CO2培养条件并没有大范围改变突变体和野生型细胞中的蛋白表达水平,但同时也存在个别变化显著的蛋白。如CupB、NdhD4、PetE和PetJ。虽然CupB和NdhD4表达水平的变化预示着C02可获得性的变化,但这些变化并不能促进Hik33突变体的光自养生长。在蓝藻中,光合电子传递链(photosynthetic electron transport,PET)和呼吸电子传递链(respiratory electron transport,RET)均位于类囊体膜上,两个电子传输链彼此相互交织并且共享几个共同组分,例如,质体醌,细胞色素b6/f符合体和可溶性电子载体等。因此,不产生NADPH的RET可能与PET在内囊体膜电子流分配上存在竞争关系。PetE和PetJ是蓝藻细胞中仅有的两个可以将电子从细胞色素b6/f复合体传递到光系统Ⅰ和/或呼吸电子传递链末端氧化酶的可溶性电子载体。正常培养条件下,与野生型细胞相比,这两个蛋白在Hik33突变体中的表达量并没有太大变化,说明在普通培养条件下Hik33缺失突变体中,PetE和PetJ并没有被诱导或抑制表达。然而,在高浓度CO2培养条件下,与野生型集胞藻细胞相比Hik33缺失突变体中PetE蛋白的表达量出现了显著上调,而PetJ的表达量却显著下调。PetE的上调和PetJ的下调可能揭示了 Hik33缺失突变体在高浓度CO2培养条件下实现快速生长的策略。在此条件下,CO2的可获得性已经不再是突变体生长的主要限制因素,但突变体的快速生长仍需要光合作用提供大量的NADPH用于CO2的固定。然而,突变体中主要光合机元件,如PsbO, PBS和PSI的下调并没有因高浓度CO2的培养条件而显著改变,NADPH的产生依赖于光系统的光电子传递,因此这仍构成了突变体实现高速生长的瓶颈。克服这个瓶颈的一个潜在的方法便是通过控制类囊体膜上电子传递的流向,使其尽可能少的流向呼吸电子传递链而最大化流向光合电子传递链,并用于NADPH生产。由于光合电子传递链和呼吸电子传递链都定位在类囊体膜上,且共享相同的两个可溶性电子传递载体PetE和PetJ。在高浓度C02培养条件下,与野生型藻细胞相比,Hik33突变体中显著上调的PetE和显著下调的PetJ可能致使类囊体膜上的电子大量流向光合电子传递链的PSI而非呼吸电子传递链的末端氧化酶,这便可以为光合电子传递链提供充足的电子,进而产生充足的NADPH供应藻细胞固定CO2使用。
【图文】：

大量研究表明植物的叶绿极有可能是由蓝藻的类囊体的片层结构演化而来逡逑（２０）。不过像蓝藻这样光合作用和呼吸作用同时存在于相同的膜系统上的物种是逡逑不多见的。蓝藻类囊体膜上的主要光合复合物结构示意图如图１－２所示。逡逑１６逡逑

光合作用仅发生在类囊体膜上，而呼吸作用既存在于类囊体膜上，，又存在于细胞逡逑质膜上（６，９－１１）。逡逑图１－１：蓝藻的细胞的结构图（６）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１：邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ａ邋ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｃｅｌｌ．逡逑１．１．２蓝藻的光合作用逡逑蓝藻的光合作用主要发生在类囊体膜，同时类囊体膜也是呼吸作用及其它生逡逑理代谢的重要场所（８）。与高等植物类似，蓝藻可进行产氧光合作用（１２）。存在于逡逑类囊体膜上的光合蛋白复合物有藻胆体（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅ）邋（１３）、光系统ＩＩ复合物逡逑（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩ）（１４，１５）、细胞色素邋ｂ６ｆ邋复合体（１６）、光系统邋Ｉ邋复合物（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ逡逑Ｉ）邋（１７）和ＡＴＰ合酶等（１８，１９）。光驱动的电子传递链贯穿于整个类囊体膜，与植物逡逑的光合作用的电子传递链非常相似，只是在蛋白复合物的组成上有些差别。实际逡逑上，大量研究表明植物的叶绿极有可能是由蓝藻的类囊体的片层结构演化而来逡逑（２０）。不过像蓝藻这样光合作用和呼吸作用同时存在于相同的膜系统上的物种是逡逑不多见的。蓝藻类囊体膜上的主要光合复合物结构示意图如图１－２所示。逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q946


本文编号：2550546