Apontic在果蝇器官发育过程中的功能分析

发布时间：2017-03-19 08:06

  本文关键词：Apontic在果蝇器官发育过程中的功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：转录因子具有结合DNA的能力,在生物发育过程中通过调控靶基因的表达发挥重要作用。对转录因子下游基因的鉴定能够很好地解释其功能。Apontic(Apt)是在果蝇中发现并在果蝇胚胎时期的气管、头部、心脏、生殖细胞发育和神经系统形成等过程中发挥重要作用的bZIP类转录因子。但是Apt在发育过程中的作用机制目前还不明确。Apt在人类中的同源基因FSBP是在人的心脏、脑、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰脏等很多组织表达的癌症相关因子,但是其作用机制也不明确。Cyclin E是细胞进入S期的关键调控因子。此外,Cyclin E因为参与细胞周期的调控,对于cyclin E的调控如果出现异常,就会引起癌症的发生。但是由于cyclin E启动子包含一个庞大的、复杂的顺式调控区域,这些区域包含组织和时期特异性组分。因此对cyclin E的调控存在时空特异性和组织特异性,很多调控cyclin E的因子有待于进一步鉴定。Hh信号作为对动物发育十分关键并且进化保守的五大信号通路之一,对生物体的发育十分关键。但是目前的研究过多的专注于Hh信号通路下游基因的研究,关于hh自身的调控目前还不明确。本研究以果蝇为研究材料,发现Apt从果蝇到人进化保守且C-末端的DNA结合结构域具有结合DNA的能力,而且在发育过程中调控两个进化保守癌症相关基因cyclin E和hh的表达。此外,Apt和Ubx一起控制唾液腺endocycle。通过对转录因子Apt的研究,能够为明确Apt人的同源基因FSBP发育过程中的作用机制提供理论依据,为认识endocycle提供新的思路。本研究的主要实验结果如下:(1)Apt在发育过程中通过调控cyclin E的表达控制细胞由G1期进入S期。在果蝇眼睛发育过程中,apt突变体克隆的部位光感受细胞受到了影响,最终导致成虫眼睛排列紊乱。超表达apt造成果蝇眼睛缺失。通过进化分析我们发现Apt从果蝇到人进化保守,并且通过电泳凝胶迁移实验证明了Apt具有结合DNA的能力。接下来通过Micorray分析和定量PCR,确定了Apt的靶基因cyclin E。研究发现在野生型果蝇眼原基,Apt和Cyclin E共表达,在apt突变体克隆的部位,cyclin E表达明显降低,超表达Apt能够诱导cyclin E的表达。此外,我们分析cyclin E启动子元件发现cyclin E含有Apt的结合位点。通过报告基因的表达最终确定Apt通过直接结合到cyclin E的启动子区域,调控cyclin E的转录,控制细胞进入S期。(2)Apt在果蝇翅膀发育过程中通过协调hh和cyclin E的表达控制细胞增殖和生长。实验过程中发现apt突变体克隆的果蝇翅膀上出现了水泡状肿瘤类似表型,并且产生克隆的翅膀会变小。在翅膀上超表达apt后引起翅膀严重变小,翅的模式完全被打乱,也出现了水泡状表型。异位表达apt后,导致翅膀的缺失。Hh在翅膀发育过程中作为“组织者”,通过激活和调控下游一系列基因时空特异性表达,控制翅的发育。通过apt和hh之间遗传学相互作用发现apt和hh之间存在调控关系。免疫荧光染色结果显示Apt和Hh在果蝇翅原基共定位。hh报告基因和Hh蛋白在apt突变体克隆里表达减少,超表达Apt能够诱导hh的表达。之后在hh启动子区域发现了Apt的结合位点,通过CRISPR/Cas9方法把结合序列进行突变。结合位点突变之后hh在mRNA和蛋白水平都显著降低,并且结合位点突变的果蝇加重hh突变体表型。之前有研究表明Hh信号能够通过转录因子Ci调控cyclin E转录。通过分析Ci和Cyclin E的表达模式以及改变Hh信号检测Cyclin E表达情况,发现cyclin E的表达不受Hh的影响。Apt能够通过结合到hh和cyclin E启动子区域,直接调控hh和cyclin E的表达,但是Apt对cyclin E的调控和Hh信号无关,并且在果蝇翅原基发育过程中,Hh信号不能调控cyclin E。(3)Apt和Ubx控制唾液腺细胞的endocycle一般的细胞周期分为G1期、S期、G2期和M期。Endocycle是一种变异的细胞周期,存在于动物和植物中,大约占到生物种类的一半以上。在endocycle细胞中,细胞只进行DNA复制,不进行有丝分裂,即只有G期和S期,没有M期。当细胞要进入S期的时候,需要cyclin E的活性,但是Cyclin E表达会抑制复制前复合体的形成,会阻止细胞进入下一个S期的进入,所以Cyclin E需要周期性地变化。在我们的研究中发现Apt能够通过调控cyclin E的表达参与细胞endocycle。在Apt诱导cyclin E的同时,还会诱导Hox基因Ubx的表达,而Ubx能够通过去掉Apt的核定位信号肽的方式使Apt蛋白从细胞核转到细胞质,从而降低细胞内cyclin E的含量,保证endocycle的进行。此外,S期的细胞也能诱导Ubx的表达,从而使Apt蛋白的定位发生改变。之前的研究表明转录因子E2f1和泛素连接酶CRL4CDT2控制唾液腺的endocycle。通过分析我们发现,E2f1依赖的endocycle对Apt的表达有微弱的影响,而这种影响还是通过Ubx引起的。因此,我们推测Apt和Ubx控制的endocycle可能在唾液腺发育过程中占主导地位。
【关键词】：转录因子 转录调控 apontic cyclin E hedgehog Ultrabithorax Endocycle
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q344
【目录】：

• 符号说明5-11
• 中文摘要11-13
• 英文摘要13-16
• 1 前言16-33
• 1.1 果蝇眼睛的发育16
• 1.2 果蝇翅的发育16-18
• 1.3 Endocycle18-19
• 1.4 Cyclin E研究进展19-23
• 1.4.1 关于cyclin E的调控概述19
• 1.4.2 Wg信号对cyclin E的调控19
• 1.4.3 Abd-A对cyclin E的调控19-20
• 1.4.4 Hh信号和cyclin E的调控20
• 1.4.5 Hippo信号对cyclin E的调控20
• 1.4.6 在中心体中Cyclin E可以通过不依赖CDK2的方式控制细胞进入S期20-21
• 1.4.7 Prospero在胶质细胞对cyclin E的调控21
• 1.4.8 Cyclin E对E2f的作用21
• 1.4.9 Cyclin E对dacapo的作用21-22
• 1.4.10 Cyclin E对Double-parked的作用22
• 1.4.11 Ago和Minus对Cyclin E的作用22-23
• 1.5 hedgehog在果蝇翅膀发育过程中的功能23-25
• 1.6 Hox基因Ubx25
• 1.7 Apt的结构及功能25-31
• 1.7.1 Apt的结构26
• 1.7.2 apt的功能26-31
• 1.7.2.1 apt在果蝇头部发育过程中的功能26-27
• 1.7.2.2 apt在果蝇气管发育过程中的功能27-28
• 1.7.2.3 apt在果蝇心脏发育过程中的功能28-29
• 1.7.2.4 apt在果蝇神经系统形成过程中的功能29
• 1.7.2.5 apt限制卵室细胞迁移29-30
• 1.7.2.6 apt在响应乙醇刺激过程中的功能30-31
• 1.7.2.7 apt的其它功能31
• 1.8 本研究的目的及其意义31-33
• 2 材料与方法33-45
• 2.1 材料33-35
• 2.1.1 果蝇及生长条件33
• 2.1.2 菌株和质粒33
• 2.1.3 酶及各种生化试剂、抗体33-34
• 2.1.4 试验中所用的引物和寡核苷酸34-35
• 2.2 方法35-45
• 2.2.1 突变体体细胞克隆的诱导35
• 2.2.1.1 果蝇重组35
• 2.2.1.2 热激处理产生突变体体细胞克隆35
• 2.2.2 大肠杆菌的转化35-36
• 2.2.3 质粒提取(试剂盒法)36
• 2.2.4 琼脂糖凝胶DNA回收（试剂盒）36-37
• 2.2.5 PCR产物纯化（试剂盒）37
• 2.2.6 利用CRISPR技术进行结合位点突变37-39
• 2.2.6.1 gRNA果蝇注射37-38
• 2.2.6.2 果蝇杂交38-39
• 2.2.6.3 粗提果蝇基因组DNA39
• 2.2.6.4 序列分析39
• 2.2.7 免疫组化（本实验中常规抗体染色均参照以下步骤进行）39-40
• 2.2.8 Caspase-3 染色40
• 2.2.9 Western Blot40-42
• 2.2.9.1 组织样品制备40-41
• 2.2.9.2 分离胶制备41
• 2.2.9.3 浓缩胶制备41
• 2.2.9.4 上样41
• 2.2.9.5 电泳41
• 2.2.9.6 转膜41
• 2.2.9.7 封闭41-42
• 2.2.9.8 一抗42
• 2.2.9.9 洗脱42
• 2.2.9.10 二抗42
• 2.2.9.11 洗脱42
• 2.2.9.12 检测42
• 2.2.10 RNA的提取（试剂盒法）42-43
• 2.2.11 反转录合成第一链cDNA43
• 2.2.12 RT-qPCR体系及反应条件43-44
• 2.2.13 UAS/GAL系统超表达和RNA干涉基因44
• 2.2.14 扫描电子显微镜观察44-45
• 3 结果与分析45-64
• 3.1 Apt在果蝇眼睛发育过程中通过诱导Cyclin E的表达控制细胞进入S期45-51
• 3.1.1 Apt是进化保守的DNA结合蛋白45
• 3.1.2 Apt在果蝇眼原基的表达分析45-46
• 3.1.3 Apt对果蝇眼睛发育的作用46-47
• 3.1.4 Apt下游靶基因的鉴定47-48
• 3.1.5 Apt在MF对Cyclin E的作用48-49
• 3.1.6 Apt对Cyclin E的调控方式分析49-51
• 3.2 Apt在果蝇翅膀发育过程中通过协调hedgehog和cyclin E的表达调控细胞增殖和生长51-59
• 3.2.1 Apt在果蝇翅原基的表达及功能分析51-52
• 3.2.2 Apt在PE对hh的作用分析52-53
• 3.2.3 Apt在果蝇翅原基对hh的作用方式分析53-55
• 3.2.4 Apt在PE对cyclin E的作用55-56
• 3.2.5 Apt在翅原基对cyclin E的作用方式分析56-57
• 3.2.6 Apt通过诱导hh和cyclin E的表达来控制细胞增殖57-59
• 3.3 Apt和Ubx控制果蝇唾液腺的endocycle59-64
• 3.3.1 Apt在唾液腺的表达和作用59
• 3.3.2 Apt在唾液腺发育过程中对cyclin E的作用分析59-61
• 3.3.3 Ubx和Apt对细胞endocycle的作用方式分析61-62
• 3.3.4 Apt，Ubx和E2f1协同唾液腺endocycle62-64
• 4 讨论64-67
• 4.1 Apt的功能64
• 4.2 Cyclin E的调控64-65
• 4.3 Hh的表达65-66
• 4.4 Hh的调控66
• 4.5 Endocycle中Apt，Ubx和Cyclin E之间的关系66-67
• 5 结论67-68
• 参考文献68-84
• 致谢84-85
• 攻读学位期间发表论文情况85

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1 王贤锋;Apontic在果蝇器官发育过程中的功能分析[D];山东农业大学;2015年

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本文编号：255756