烟草C3H2C3型RING蛋白NtRCP1的功能分析

发布时间：2017-03-19 09:03

  本文关键词：烟草C3H2C3型RING蛋白NtRCP1的功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：泛素/26S蛋白酶途径是真核生物中最重要的蛋白降解系统。泛素分子首先被连接到需要降解的蛋白质的赖氨酸残基上,然后被26S蛋白酶体识别并降解。整个泛素化过程依次由泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)介导完成,其中E3连接酶尤为重要,因其除了连接功能外还具有高度的底物识别特异性。RING(Really interesting new gene)蛋白是E3连接酶家族的重要成员,其种类繁多,功能涉及到植物整个生活史,包括种子的发育、叶片形态建成及花发育等,并且在应答各种生物或非生物胁迫过程中发挥重要功能。迄今为止,拟南芥中已经分离鉴定了多个RING蛋白家族成员,其细胞内功能也不断被揭示,而烟草中仅克隆鉴定了一个影响植株生长发育的C3HC4型RING蛋白。本论文利用分子生物学、生物化学、细胞生物学及反向遗传学等方法对烟草BY-2细胞中一个C3H2C3型RING蛋白NtRCP1(Nicotiana tobacum RING-domain-containing protein1)的功能进行了分析鉴定,相关研究结果对于系统了解RING家族蛋白的生物学功能具有重要的科学意义。 NtRCP1是利用裂殖酵母体系筛选出的细胞分裂相关基因。酶活分析表明NtRCPl是一个有功能的E3连接酶,在E1和E2的存在下能够催化泛素形成由高到低分子量梯度条带。在烟草中过量表达NtRCP1能促进植株从营养生长到生殖生长的转换,转基因烟草开花时间提前,而抑制该基因表达能够在一定程度上推迟开花。细胞学分析显示与野生型相比,过量表达NtRCP1的转基因烟草茎顶端中分生组织细胞明显增多,暗示NtRCP1能通过促进细胞分裂参与开花起动所需的形态建成。基因表达分析表明NtRCPl基因在烟草的各个组织器官中均有表达,根中略低,并且其在生殖生长阶段的茎顶端分生组织中的表达量比营养生长阶段明显升高。在BY-2模式细胞中过量表达NtRCP1,分析其在细胞分裂周期中的功能,结果表明提高NtRCP1基因表达水平能促进细胞分裂,究其原因是由于细胞周期进程中的G2期缩短。这些研究结果暗示NtRCP1可能是烟草开花途径的调控因子之一,在烟草从营养生长向生殖生长过渡时期,NtRCP1可能通过泛素化降解某个控制G2至M期转换的靶蛋白,促进茎顶端分生组织的细胞分裂及开花起始相关的形态建成,从而参与对开花时间的调控。 此外,由于许多RING蛋白既能参与植物生长发育也能参与应答各种生物或非生物胁迫,而NtRCP1受非生物胁迫诱导表达,因此,对其在应答环境胁迫中的功能进行了初步分析。结果表明在烟草中过量表达NtRCP1能够减缓氧化胁迫伤害,而抑制NtRCP1表达则能增强伤害程度；与野生型相比,过量表达NtRCP1的烟草叶片中叶绿素下降减缓、丙二醛含量升高延缓,并且清除活性氧的抗坏血酸氧化酶活性下降相对缓慢。由此推测,NtRCP1可能通过参与调控抗氧化酶活性来维持逆境下细胞内的活性氧平衡。 综上所述,NtRCP1可能是烟草中一个具有双重功能的RING蛋白,在调控植物从营养生长到生殖生长转换以及抵御外界非生物胁迫中发挥作用。相关的研究结果不仅能够为烟草RING家族成员的理论研究增添实验依据,而且可望为烟草耐逆和生长周期调控分子育种提供目标基因。
【关键词】：RING蛋白 细胞分裂 开花起始 非生物胁迫应答 活性氧
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q946.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 主要缩写9-11
• 第一章 文献综述11-33
• 1.1 E3连接酶的种类11-13
• 1.1.1 单亚基E3连接酶11-13
• 1.1.2 多亚基E3连接酶13
• 1.2 RING蛋白研究进展13-28
• 1.2.1 RING蛋白在细胞周期调控中的功能14-17
• 1.2.2 RING蛋白在植物营养生长到生殖生长转换中的功能17-20
• 1.2.3 RING在植物应答非生物胁迫中的功能20-25
• 1.2.4 RING蛋白在植物应答生物胁迫中的功能25-28
• 1.3 烟草开花机理研究进展28-32
• 1.3.1 烟草成花时期的细胞形态建成28-30
• 1.3.2 影响烟草开花的因素30-31
• 1.3.3 烟草成花的分子机制31-32
• 1.4 研究目的和意义32-33
• 第二章 实验材料与方法33-43
• 2.1 实验材料33
• 2.1.1 植物材料33
• 2.1.2 宿主菌及质粒33
• 2.1.3 试剂33
• 2.1.4 植物培养材料33
• 2.2 仪器设备33-34
• 2.3 实验方法34-43
• 2.3.1 基因克隆及植物表达载体构建34
• 2.3.2 序列比对分析34
• 2.3.3 BY-2细胞培养及同步化34-35
• 2.3.4 植物种子消毒处理35
• 2.3.5 农杆菌介导的植物和细胞转化35-36
• 2.3.6 DNA提取和PCR分析36-37
• 2.3.7 RNA提取和基因表达量分析37-38
• 2.3.8 NtRCP1融合蛋白的体外泛素化活性分析38
• 2.3.9 亚细胞定位观察38-39
• 2.3.10 烟草BY-2细胞和植株的非生物胁迫分析39
• 2.3.11 叶绿素含量测定39
• 2.3.12 MDA含量测定39-40
• 2.3.13 叶绿素荧光分析40
• 2.3.14 抗氧化酶活性测定40-41
• 2.3.15 烟草茎顶端切片41
• 2.3.16 本论文所用引物41-43
• 第三章 NtRCP1在烟草生长发育中的功能43-53
• 3.1 NtRCP1的生化活性分析43-45
• 3.2 过量和抑制NtRCP1表达转基因烟草的获得和鉴定45-46
• 3.3 过量表达NtRCP1能够促进烟草开花46-47
• 3.4 过量表达NtRCP1能够促进茎顶端分生组织的细胞分裂47-49
• 3.5 NtRCP1在烟草组织器官中的表达分析49-50
• 3.6 过量表达NtRCP1的BY-2细胞表型分析50-53
• 第四章 NtRCP1在非生物胁迫应答中的功能53-60
• 4.1 NtRCP1对非生物胁迫的应答53-54
• 4.2 过量表达NtRCP1能够提高烟草BY-2细胞对非生物胁迫的耐受性54-55
• 4.3 NtRCP1的表达变化没有改变对盐和干旱胁迫的耐受性55-56
• 4.4 过量表达NtRCP1能够提高烟草的耐氧化能力56-59
• 4.5 NtRCP1的亚细胞定位59-60
• 第五章 讨论60-64
• 5.1 NtRCP1转录水平的表达受多种因素诱导60
• 5.2 NtRCP1能够通过调控细胞周期进程促进烟草开花60-61
• 5.3 NtRCP1可能通过调控抗氧化酶的活性提高烟草对氧化胁迫的耐受性61-62
• 5.4 NtRCP1可能是一个具有双重功能的RING蛋白62-64
• 第六章 结论和展望64-84
• 6.1 结论64
• 6.2 展望64-65
• 参考文献65-84
• 综述84-94
• 参考文献93-94
• 致谢94-95
• 作者简历95-96

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 全先庆,高文;盐生植物活性氧的酶促清除机制[J];安徽农业科学;2003年02期

2 赵江涛;李晓峰;李航;徐睿_

本文编号：255802