应用基因敲除小鼠模型研究PZR的生物学功能

发布时间：2019-11-08 23:16

【摘要】：PZR(Protein zero related)是由美国俄克拉荷马大学健康科学中心赵志壮教授于1998年发现、分离纯化、克隆并命名的一种糖蛋白,它属于免疫球蛋白受体家族,是蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-2的特异性结合蛋白和底物。人源PZR由MPZL1(Myelin protein zero-like 1)基因编码,广泛表达于心脏、胎盘、肾脏、胰腺和肌肉等组织中,它的胞外区含有一个免疫球蛋白样结构域,其与髓鞘P0蛋白有46%的同源性,故将其命名为髓鞘P0蛋白相关蛋白。PZR胞内部分含有两个免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM),其中Tyr 241和Tyr 263是主要的酪氨酸磷酸化位点。当PZR胞内ITIM中的Tyr 241和Tyr 263发生磷酸化后,就可以与SHP-2的两个SH2结构域特异性的结合,从而招募并激活SHP-2。目前,国内外对PZR生物功能的研究还非常有限,我们知道,PZR是SHP-2的特异性相互作用蛋白,而SHP-2的异常又与各种恶性疾病有着密不可分的关系。研究表明,约50%的努南综合征以及约90%的豹斑综合征患者体内检测到了SHP-2突变。值得一提的是,努南综合征和豹斑综合征的表型非常相似(智力低下、身材矮小、面部畸形、先天性心脏病以及骨骼肌异常),它们分别由SHP-2的激活和失活突变导致,提示这两种综合征可能与同一条信号通路相关。另外,SHP-2激活突变发生在35%的青少年单核细胞白血病、4%的急性髓系白血病和一定数量的其它癌症如肺癌、胃癌、结肠癌、脑癌、乳腺癌等的患者中。PZR是作为SHP-2的上游特异性结合蛋白和底物被发现的,因此PZR很可能对上述疾病的发生和发展起到至关重要的作用。自20世纪80年代以来,基因打靶技术开始兴起,极大地推动了生物学研究和医药的开发,基因研究从基本的图谱绘制和测序渐渐发展为针对基因功能的研究和对致病机制的解析,这使得现代医学领域和生物学领域研究取得了突飞猛进的发展。TALEN技术作为基因打靶的成员之一,有着打靶效率高且脱靶效应低、制备简单、成本低等优点,成为了本课题较理想的基因靶向修饰工具。本课题以C57BL6小鼠为研究模型,首次应用TALEN技术建立了PZR敲除小鼠模型,利用PCR和Western Blot等分子生物学手段验证了模型的构建,应用荧光定量RT-PCR对不同组织的特定基因表达水平进行检测。观察了PZR敲除后小鼠体重、外观、组织形态学等的变化。利用小鼠转录组基因芯片分析了PZR+/+与PZR-/-小鼠卵巢组织中基因表达量的变化情况,为系统地研究PZR的生物学功能及与之相关疾病的防治奠定了基础并提供了一种非常有价值的动物模型。1.PZR敲除小鼠模型的构建及表型分析C57BL6小鼠的MPZL1(m MPZL1)编码框序列为2356bp,含6个外显子,编码270个氨基酸;人MPZL1(h MPZL1)的编码框序列为5026bp,含6个外显子,编码269个氨基酸。本实验针对PZR蛋白编码基因MPZL1进行分析,选择MPZL1-exon2作为敲除区块,该区块目的碱基缺失将使PZR转录提前终止。(1)在基因水平上,利用PCR技术、SSCP方法和基因组测序对PZR+/+、PZR+/-和PZR-/-小鼠加以区分;在蛋白水平上,利用免疫印迹方法鉴定了PZR-/-小鼠体内各组织中PZR蛋白表达量的变化;利用荧光定量PCR技术测定了PZR-/-小鼠卵巢组织中MPZL1基因m RNA的表达量;结果均显示模型小鼠体内的PZR被成功敲除。(2)选择PZR小鼠进行交配,大量繁殖出PZR和PZR小鼠,对其体重、外观形态及血液指标等进行观测。结果发现PZR-/-与PZR+/+小鼠在外观形态上并无明显变化;自3周断奶起PZR-/-小鼠体重明显低于同期的PZR+/+小鼠,股骨、脏器组织系数则无明显变化;此外,我们通过检测血脂指标发现,PZR-/-小鼠空腹胆固醇和甘油三酯的含量明显低于PZR+/+小鼠(p0.05);利用石蜡切片和H.E染色技术,观察PZR+/-和PZR-/-小鼠小鼠各组织形态结构,发现在睾丸和卵巢组织中,PZR-/-小鼠的生殖系统出现一定的发育迟缓现象,而在肝脏组织中,发现肝细胞有不同程度的水肿。2.PZR敲除小鼠基因水平变化的研究(1)我们采用基因芯片技术分析了雌性PZR-/-和PZR+/+小鼠卵巢组织转录组之间的表达差异,结果发现,与胆固醇和甘油三酯代谢通路相关的一些基因表达量明显上调,如Insig1、Srebf1和Fasn。随后我们以肝脏组织为样本,利用RT-PCR技术对这三个基因进行验证,结果与芯片分析具有相同的上调趋势。(2)通过免疫印迹技术,我们进一步发现PZR-/-小鼠肝脏组织中INSIG1和FASN蛋白表达量均高于PZR+/+小鼠。但这些蛋白质是如何与PZR进行相互作用仍需进一步的研究。本课题为进一步研究和明确PZR的生物学功能奠定了基础。
【图文】：

结构与功能壮教授首次发现了一种能与 SHP-2 特域与 Myelin P0 具有 46%的同源性，属包含了 2 个免疫受体酪氨酸抑制基ition motifs，ITIM），分别位于胞内区）和 Tyr 263（序列为 VVYADI）位点 PZR（protein zero related），基因名为 M，位于人常染色体 1q24.1-24.2，该蛋白和肌肉等组织中，参与细胞的粘附和细，含 6 个外显子，，编码 269 个氨基酸；bp，含 6 个外显子，编码 270 个氨基酸

包含SH2结构域的PTP底物（XuXJ，BBRC，2002）
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：2558096