PMAP-36的分子改良及其作用机理的研究

发布时间：2017-03-20 05:10

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【摘要】：PMAP-36是来源于猪骨髓含36个氨基酸的阳离子抗菌肽。本研究以PMAP-36为模板,通过优化相关结构参数,如两亲性、结构倾向性等对其进行改良,在此基础上测定了改良肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R的抗菌活性和作用机理;筛选出具有特异性抗绿脓杆菌肽T9W,评估了T9W抗绿脓杆菌效果;基于T9W序列特征,全新设计一系列含有七肽重复序列的抗菌肽,比较了这些肽在抗绿脓杆菌和作用机制方面的差异。主要研究结果如下:(1)非完美两亲性抗菌肽的设计。两亲性是影响抗菌肽活性的重要参数之一。完美两亲性结构通常可以提高抗菌肽的活性,但同时也会引起细胞毒性的增加。通过分析PMAP-36序列及氨基酸组成,采用序列截短和氨基酸替换方法,设计一系列非完美两亲性α-螺旋抗菌肽。首先,截取PMAP-36 N端16个氨基酸序列,命名为RI16。与PMAP-36相比,RI16具有完美的两亲性结构。根据α-螺旋蛋白折叠原则,利用色氨酸(Trp)替换两亲性结构极性面中的成对的赖氨酸(Lys)设计了一系列非完美两亲性抗菌肽。结果表明,具有氢键连接的Trp改良肽PRW4具有较强的广谱抗菌活性,其最小抑菌浓度(MIC)在4-8μM之间,同时不具有细胞毒性。PRW4可透化细菌细胞外膜和内膜,引起膜电势发生改变,破坏细胞膜完整性。扫描电镜和透射电镜观测结果表明,PRW4引起细胞膜形态发生改变,细胞内容物释放,表明PRW4通过破坏细胞膜发挥抗菌作用。这些结果表明,适度破坏抗菌肽的两亲性在提高抗菌活性的同时,能够降低细胞毒性。(2)具有不同螺旋倾向性抗菌肽的设计。为了进一步验证和研究非完美两亲性抗菌肽的优化或设计方法,以PRW4为模板,分别利用具有不同螺旋倾向性的氨基酸半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和D-色氨酸(D-Trp)替换PRW4中的Trp。同时,为了研究精氨酸(Arg)的重要作用,将PRW4中的Lys全部替换成Arg。结果表明,与PRW4相比,D-Trp取代的抗菌肽PRW4-d比Cys(C4)、Asp(D4)、Ile(I4)和Pro(P4)取代的抗菌肽活性高。而且,Arg取代抗菌肽PRW4-R的抗菌活性和细胞选择性进一步提高。优化的肽序列PRW4-d和PRW4-R通过引起细胞膜电势能损失,通透性增加,完整性破坏发挥抗菌作用。这些结果对设计或优化短链抗菌肽具有一定的借鉴意义。(3)疏水面完整性对抗菌肽活性的影响。在两亲性结构中,疏水面的完整性对抗菌肽的活性具有重要影响。RI16疏水面的中心位置是一个中性氨基酸苏氨酸(Thr),为了研究疏水面完整性对抗菌肽活性的影响,以RI16为模板,分别利用带正电荷氨基酸Lys(T9K)、疏水性氨基酸Ile(T9I),以及芳香族氨基酸Trp(T9W)和苯丙氨酸(Phe)(T9F)替换RI16序列中的Thr。结果表明,疏水面的完整性与抗菌肽的抗菌活性之间没有显著的相关关系。疏水面中心位置的Trp是抗菌肽T9W发挥抗绿脓杆菌活性的关键。T9W具有较强的抗绿脓杆菌活性,包括临床和耐药菌株,其MIC为1-2μM,致死浓度(LC)为1-4μM,表明T9W通过杀菌机制发挥抗绿脓杆菌活性。杀菌动力学试验结果表明,T9W在30 min(1×LC)或5 min(4×LC)内可快速杀死绿脓杆菌,包括耐药菌株。而且,T9W与抗生素环丙沙星和庆大霉素具有协同效应。细胞毒性试验结果表明,T9W对红细胞和巨噬细胞均没有毒性。细胞选择性试验结果进一步表明,T9W能够有效地清除细胞外的绿脓杆菌,而对细胞本身没有毒性。此外,T9W还具有较强的盐离子稳定性和抗生物被膜(biofilm)活性。T9W主要是通过与绿脓杆菌细胞外膜LPS结合,聚集在细胞表面,破坏质膜完整性,引起细胞内容物泄漏,从而达到杀菌目的。这些结果表明T9W具有开发成抗绿脓杆菌药物的潜力。(4)七肽重复序列抗菌肽的全新设计。根据T9W的序列特征,利用亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、Trp、Phe和Arg,全新设计含有七肽重复序列模型的抗菌肽分子,其序列模型为(abcdefg)n-(W)n-(gfedcba)n(a和d分别为Leu、Ala、Trp和Phe,b、c、e、f和g为Arg,W为Trp,n为重复单位)。结果表明,a和d位置为Leu的肽序列具有更强的抗菌活性。七肽重复序列的延长诱导肽链形成coiled-coil结构,表现出较强的抗菌活性,而增加七肽重复序列之间的Trp影响肽链螺旋结构的形成和细胞选择性。优化的肽序列能够有效地清除绿脓杆菌biofilm,中和内毒素,以及具有较强的盐离子稳定性。此外,这些肽序列能够引起细胞膜通透性增加,质膜完整性破坏,从而发挥抗菌活性。本研究以猪源抗菌肽PMAP-36为模板,通过破坏抗菌肽两亲性的思路设计了一系列的α-螺旋抗菌肽,筛选出的抗菌肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R具有广谱抗菌活性;优化的抗菌肽T9W具有特异性抗绿脓杆菌活性;设计的含有七肽重复序列的抗菌肽也具有较强的抗绿脓杆菌活性。初步探明筛选出的改良肽是通过与细胞膜相互作用发挥抗菌功能的。这些结果为研制新型抗菌药物提供了优良的候选抗菌肽,为有效替代或减少抗生素作为饲料添加剂的使用、提高畜产品安全性等方面具有重要借鉴和参考意义。
【关键词】：PMAP-36 机制 改造 两亲性 绿脓杆菌
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 引言15-29
• 1.1 抗菌肽研究概述15-19
• 1.1.1 抗菌肽的分类15-17
• 1.1.2 抗菌肽的物理化学和结构参数17-19
• 1.2 抗菌肽的作用机制19-22
• 1.3 抗菌肽的生物学功能22-25
• 1.3.1 抗细菌22-23
• 1.3.2 抗真菌23-24
• 1.3.3 抗癌24
• 1.3.4 抗虫24
• 1.3.5 抗病毒24-25
• 1.3.6 免疫调节25
• 1.4 猪源抗菌肽PMAP-36的研究进展25-27
• 1.4.1 PMAP-36的来源与结构25-26
• 1.4.2 PMAP-36的抗菌性和溶血性26
• 1.4.3 PMAP-36的作用机制26-27
• 1.5 本研究的目的意义和主要内容27-29
• 2 材料与方法29-39
• 2.1 试验材料29-30
• 2.1.1 抗菌肽合成29
• 2.1.2 菌株29
• 2.1.3 试剂29-30
• 2.1.4 仪器30
• 2.2 二级结构的测定30-31
• 2.3 抗菌肽的生物学活性测定31-35
• 2.3.1 抗菌活性的测定31-32
• 2.3.2 细胞毒性的测定32-34
• 2.3.3 盐离子稳定性的测定34
• 2.3.4 抗生物被膜（BIOFILM）活性的测定34-35
• 2.3.5 内毒素中和活性的测定35
• 2.4 抗菌肽的抑菌机理35-38
• 2.4.1 外膜通透性的测定35-36
• 2.4.2 内膜通透性的测定36
• 2.4.3 细胞电势能的测定36-37
• 2.4.4 细胞膜完整性的测定37
• 2.4.5 细胞膜形态的观测37-38
• 2.5 数据分析38-39
• 3 结果与分析39-88
• 3.1 抗菌肽分子改良与设计39-45
• 3.1.1 非完美两亲性抗菌肽的设计39-41
• 3.1.2 低Α-螺旋倾向性抗菌肽的设计41-42
• 3.1.3 抗菌肽RI16的分子改造42-44
• 3.1.4 七肽重复序列抗菌肽的全新设计44-45
• 3.2 抗菌肽的二级结构分析45-50
• 3.2.1 非完美两亲性抗菌肽的设计45-46
• 3.2.2 低Α-螺旋倾向性抗菌肽的设计46-48
• 3.2.3 抗菌肽RI16的分子改造48-49
• 3.2.4 七肽重复序列抗菌肽的全新设计49-50
• 3.3 抗菌肽的生物学活性50-64
• 3.3.1 抗菌活性50-55
• 3.3.2 抗菌肽的细胞毒性与选择性55-57
• 3.3.3 盐离子稳定性57-61
• 3.3.4 抗BIOFILM活性61-63
• 3.3.5 内毒素中和活性63-64
• 3.4 抗菌肽的作用机理64-88
• 3.4.1 外膜通透性64-67
• 3.4.2 内膜通透性67-69
• 3.4.3 质膜电势能变化69-74
• 3.4.4 细胞膜完整性的测定74-77
• 3.4.5 细胞膜完整性的观测77-88
• 4 讨论88-102
• 4.1 抗菌肽分子改良与设计88-91
• 4.1.1 非完美两亲性抗菌肽的设计88-89
• 4.1.2 低Α-螺旋倾向性抗菌肽的设计89-90
• 4.1.3 抗菌肽RI-16的分子改造90
• 4.1.4 七肽重复序列抗菌肽的全新设计90-91
• 4.2 抗菌肽的二级结构91-94
• 4.2.1 非完美两亲性抗菌肽的设计91-92
• 4.2.2 低Α-螺旋倾向性抗菌肽的设计92-93
• 4.2.3 抗菌肽RI-16的分子改造93
• 4.2.4 七肽重复序列抗菌肽的全新设计93-94
• 4.3 抗菌肽的生物学活性94-100
• 4.3.1 抗菌活性94-97
• 4.3.2 抗菌肽的细胞毒性和选择性97-98
• 4.3.3 盐离子稳定性98
• 4.3.4 抗BIOFILM活性98-99
• 4.3.5 内毒素中和活性99-100
• 4.4 抗菌肽的作用机理100-102
• 5 结论102-103
• 致谢103-104
• 参考文献104-121
• 攻读博士学位期间发表的学术论文121-122

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