枸杞β-胡萝卜素羟化酶基因及其启动子的克隆和研究
发布时间：2017-03-21 08:01
本文关键词：枸杞β-胡萝卜素羟化酶基因及其启动子的克隆和研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：类胡萝卜素是一类天然的脂溶性色素,在真菌、细菌和植物中都有类胡萝卜素的存在。类胡萝卜素还是一种重要的光合色素,它一般广泛地位于光合组织中。在光合组织中,类胡萝卜素可以淬灭活性氧和保护DNA免受损伤。玉米黄质是一种叶黄素,它是由β-胡萝卜素羟化酶催化β-胡萝卜素产生的。枸杞是一种传统的中草药,具有很多重要的生物功能,例如抗癌、抗衰老、抗氧化。然而,目前还没有关于枸杞中β-胡萝卜素羟化酶的报道。本研究克隆了枸杞β-胡萝卜素羟化酶基因,通过生物信息学深入分析了枸杞β-胡萝卜素羟化酶的特点,并将该基因转入烟草进行表达,研究了该基因在植物抵抗非生物逆境中的生物学功能。首先,利用3'-cDNA末端快速扩增技术(3'-RACE),克隆了枸杞中β-胡萝卜素羟化酶基因(chyb)的开放阅读框。枸杞chyb基因全长939 bp,编码的CHYB蛋白分子量为34.8 kDa,预测其等电点为8.36。生物信息学分析表明,枸杞CHYB蛋白定位于叶绿体。为了进一步分析枸杞CHYB的催化功能,本研究在大肠杆菌细胞内进行了功能互补分析实验。从结果可以看出,枸杞CHYB可以催化β-胡萝卜素发生反应生成玉米黄质,为生物合成玉米黄质提供了新的途径。然后,本文研究了枸杞chyb基因在植物中的功能。在转基因烟草中,检测到叶黄素循环池容量明显增加,这与β-胡萝卜素羟化酶催化产生玉米黄质是分不开的。在渗透胁迫条件下,转基因烟草的根长和生物量明显地高于非转基因对照组。在干旱胁迫条件下,转基因烟草的叶片失水速度比非转基因的慢,光合速率和SOD活性明显较高,而气孔导度和丙二醛含量明显较低。在盐胁迫条件下,转基因烟草的叶绿素和脯氨酸含量明显地高于非转基因对照组,而丙二醛含量和Na+/K+明显地较低。通过以上研究结果表明,枸杞chyb基因在烟草中表达,增加了叶黄素循环池的容量,从而使转基因烟草具有抵抗干旱逆境和盐渍逆境的能力,为植物耐旱和耐盐分子育种提供了重要的备选基因。最后,为了研究枸杞chyb基因启动子在调控基因表达方面的作用,本研究克隆了枸杞chyb基因的启动子chybpro。生物信息学分析结果表明,在枸杞chybpro序列中存在多个光响应元件和胚乳特异性表达元件,为植物光响应和胚乳特异性表达提供了新的启动子。
【关键词】：枸杞 类胡萝卜素 β-胡萝卜素羟化酶 玉米黄质 烟草
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：
- 摘要4-5
- ABSTRACT5-12
- 第一章 绪论12-28
- 1.1 类胡萝卜素理化特性12-14
- 1.1.1 类胡萝卜素结构特性12
- 1.1.2 类胡萝卜素多烯链中独特的电子云分布12-13
- 1.1.3 多样的类胡萝卜素氧化裂解反应13-14
- 1.2 类胡萝卜素的生物合成14-18
- 1.2.1 萜类化合物的生物合成14
- 1.2.2 植物细胞质体中的非甲羟戊酸途径14-15
- 1.2.3 高等植物类胡萝卜素的生物合成15-17
- 1.2.4 含氧类胡萝卜素衍生物的生物合成17-18
- 1.3 类胡萝卜素生物合成途径的调节控制及其基因工程研究18-21
- 1.3.1 类胡萝卜素生物合成途径的调节控制18-19
- 1.3.2 类胡萝卜素代谢途径的基因工程研究19-21
- 1.4 植物类胡萝卜素生物学功能21-22
- 1.5 β-胡萝卜素羟化酶的生物学功能22-23
- 1.5.1 β-胡萝卜素羟化酶在抵抗干旱逆境中的作用22-23
- 1.5.2 β-胡萝卜素羟化酶在抵抗强光照射中的作用23
- 1.6 枸杞 β-胡萝卜素羟化酶基因启动子的研究23-24
- 1.7 植物的遗传转化方法研究24-25
- 1.8 本研究的目的意义、研究内容与技术路线25-28
- 1.8.1 本研究的目的意义25-26
- 1.8.2 研究内容26
- 1.8.3 技术路线26-28
- 第二章 枸杞chyb基因的克隆及生物信息学分析28-44
- 2.1 实验材料与仪器设备28-30
- 2.1.1 植物材料28
- 2.1.2 质粒及菌株28
- 2.1.3 主要仪器设备28-29
- 2.1.4 本研究所用的培养基29
- 2.1.5 本研究所用的主要试剂及贮液29-30
- 2.2 实验方法30-37
- 2.2.1 引物设计与DNA序列测序30-31
- 2.2.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞31
- 2.2.3 热击法转化大肠杆菌31
- 2.2.4 质粒的小量提取31-32
- 2.2.5 质粒大量提取32
- 2.2.6 核酸琼脂糖凝胶电泳32-33
- 2.2.7 DNA切胶回收与产物纯化33
- 2.2.8 枸杞叶片总RNA提取33
- 2.2.9 3'-RACE克隆chyb基因33-34
- 2.2.10 chyb基因克隆载体构建34-35
- 2.2.11 连接产物的验证35-36
- 2.2.12 生物信息学分析36
- 2.2.13 枸杞chyb基因转录水平分析36-37
- 2.3 结果与分析37-42
- 2.3.1 枸杞叶片总RNA的提取37
- 2.3.2 chyb基因的克隆与分析37-39
- 2.3.3 枸杞CHYB特性39-40
- 2.3.4 枸杞CHYB结构分析40-41
- 2.3.5 枸杞CHYB蛋白进化分析41-42
- 2.3.6 枸杞chyb基因组织特异型表达分析42
- 2.4 讨论42-43
- 2.5 小结43-44
- 第三章 枸杞chyb基因在大肠杆菌中的表达44-54
- 3.1 实验材料44-45
- 3.1.1 载体和菌株44
- 3.1.2 主要仪器44-45
- 3.1.3 本研究所用主要试剂及贮液45
- 3.1.4 本研究所用的培养基45
- 3.2 实验方法45-49
- 3.2.1 大肠杆菌表达载体pET-28a-chyb的构建45-47
- 3.2.2 pET-28a-chyb与互补质粒pACCAR16ΔcrtX的共转化47
- 3.2.3 诱导表达47
- 3.2.4 重组蛋白的分离纯化47-48
- 3.2.5 重组蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测48-49
- 3.2.6 类胡萝卜素的提取49
- 3.2.7 类胡萝卜素的高压液相色谱（HPLC）检测49
- 3.3 结果与分析49-52
- 3.3.1 大肠杆菌表达载体pET-28a-chyb的构建49-50
- 3.3.2 枸杞chyb基因在大肠杆菌中的表达50-51
- 3.3.3 枸杞chyb基因在大肠杆菌中的功能互补分析51-52
- 3.4 讨论52-53
- 3.5 小结53-54
- 第四章 异源表达枸杞chyb基因提高烟草抵抗非生物逆境的研究54-76
- 4.1 实验材料54-57
- 4.1.1 植物材料54
- 4.1.2 质粒和菌株54
- 4.1.3 主要仪器54-55
- 4.1.4 主要试剂55-56
- 4.1.5 实验所用培养基56-57
- 4.2 实验方法57-66
- 4.2.1 大肠杆菌表达载体pCAMBIA2300-chyb构建57-59
- 4.2.2 烟草叶盘转化方法59-60
- 4.2.3 转基因烟草分子检测60-62
- 4.2.4 烟草类胡萝卜素的含量测定62-63
- 4.2.5 烟草叶片脱落酸（ABA）含量测定63
- 4.2.6 脯氨酸含量测定63-64
- 4.2.7 SOD含量的测定64-65
- 4.2.8 MDA含量的测定65
- 4.2.9 Na~+、K~+含量测定65
- 4.2.10 叶绿素含量测定65-66
- 4.2.11 逆境处理与生理指标测定66
- 4.3 结果与分析66-73
- 4.3.1 转基因烟草的外源基因整合与表达分析66-68
- 4.3.2 转基因烟草对于渗透胁迫的耐受性68
- 4.3.3 转基因烟草中类胡萝卜素与ABA的含量68-69
- 4.3.4 枸杞chyb基因在干旱胁迫条件下的作用69-71
- 4.3.5 盐胁迫下烟草细胞内Na~+/K~+、脯氨酸、MDA、叶绿素含量的测定71-73
- 4.4 讨论73-75
- 4.5 小结75-76
- 第五章 枸杞chyb基因启动子的克隆及其功能分析76-93
- 5.1 实验材料76-77
- 5.1.1 植物材料76
- 5.1.2 质粒和菌株76
- 5.1.3 主要仪器76-77
- 5.1.4 主要试剂77
- 5.1.5 所用培养基77
- 5.2 实验方法77-84
- 5.2.1 枸杞chyb启动子的克隆77-80
- 5.2.2 高效连接启动子的植物基因工程载体构建方法80-83
- 5.2.3 枸杞chybpro与pJWW0230连接83
- 5.2.4 载体pJWW0230-chybpro与GFP荧光蛋白基因的连接83
- 5.2.5 烟草叶片瞬时表达83-84
- 5.3 结果与分析84-90
- 5.3.1 枸杞基因组提取结果84
- 5.3.2 枸杞chybpro的克隆84-86
- 5.3.3 枸杞chybpro的生物信息学分析86-87
- 5.3.4 高效连接启动子的植物基因工程载体构建及枸杞chybpro的功能鉴定87-90
- 5.4 讨论90-92
- 5.4.1 TAIL-PCR技术的应用前景90-91
- 5.4.2 枸杞chybpro启动子功能及应用91
- 5.4.3 植物基因工程表达载体pJWW0230的应用91-92
- 5.5 小结92-93
- 第六章 结论与展望93-96
- 6.1 研究总结93-94
- 6.2 创新点94
- 6.3 展望94-96
- 参考文献96-106
- 发表论文和参加科研情况说明106-108
- 致谢108-109
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本文编号：259266
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/jckxbs/259266.html
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