大丽轮枝菌分泌蛋白质组学及酵母同源蛋白的结构和功能研究

发布时间：2017-03-21 09:04

  本文关键词：大丽轮枝菌分泌蛋白质组学及酵母同源蛋白的结构和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：大丽轮枝菌是广泛分布在土壤中的一种病原真菌,可以引起植物黄萎病,在全世界范围内造成巨大的经济损失。大丽轮枝菌不但可以让植物叶片大面积发黄褪色,更为严重的是可以入侵到植物体内,堵塞导管和维管束,最后造成植物坏死和腐烂。但是,目前还未发现有效根治黄萎病的方法,对大丽轮枝菌如何入侵植物体内的理解不够清晰,对宿主植物和大丽轮枝菌的具体互作机制也不清楚,大丽轮枝菌毒力相关蛋白的功能研究也还处在初步阶段。 有文献报道,病原真菌在低氮的环境条件下入侵植物,很多与病原真菌毒力有关的激发子蛋白迅速诱导表达,这也和病原真菌入侵植物时面临的营养缺乏时氮源利用相关基因的大量表达是相似的。营养压力,特别是低氮限制的压力也被证明是影响病原真菌生长和发育最关键的因素之一。总之,当病原真菌入侵植物时,植物内环境对真菌而言是一个氮源限制的环境,或者说在体外可以通过氮源限制来模拟病原真菌入侵植物时的内部环境。 在致病菌与植物的相互作用过程中涉及到众多的信号分子的识别与传导。其中,真菌的分泌蛋白在这个过程中起着不可或缺的作用。事实上,这些病原真菌的致病性因子和激发子蛋白都是需要分泌到细胞外才能行使其生物学功能。 近年来,随着基因组测序技术的迅猛发展,大量植物病原菌基因组的序列被测定,因此利用这些数据库平台并借助蛋白质组学的方法可以鉴定这些病原菌中的关键毒力因子蛋白。我们利用凝胶电泳后切胶回收和直接在溶液中进行酶解两种方法,并结合多维液相色谱与质谱联用技术(LC-MS/MS)研究了大丽轮枝菌在低氮限制条件下分泌的蛋白质组。我们共鉴定出214个蛋白质,通过序列分析和GO(Gene Ontology)基因功能注释,发现它们包括与细胞结构相关的10类蛋白、与分子功能相关的8类蛋白以及参与生物过程处理的19类蛋白。通过细胞定位的分析,我们筛选出33种分泌蛋白,这些蛋白的等电点分布从4.56到9.51,分子量为13-86kDa。结合NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对和GO基因功能注释,可以将这些分泌蛋白大致分为6大类型：激发子蛋白和免疫原性蛋白、降解/重建细胞壁相关酶类、蛋白酶和酯酶类、能量代谢和蛋白代谢调控蛋白、氧化还原酶类、未知功能蛋白。降解／重建细胞壁相关酶类负责突破植物细胞壁屏障,激发子蛋白以及免疫原性蛋白会启动植物的免疫反应,其他一些代谢相关蛋白负责消除入侵过程中的氧化压力和营养限制,保证自身的营养供给和能量来源,最终完成侵染植物的过程。 我们对分泌蛋白质组学的研究为鉴定大丽轮枝菌的毒力因子奠定了基础,并为进一步研究黄萎病的生物防治提供了理论指导。 同时,我们对上述的一个分泌蛋白磷脂酰甘油/磷脂酰肌醇转移蛋白(PG/PTTP)酿酒酵母中的同源蛋白Npc2在大肠杆菌中进行了重组表达,并利用亲和层析和分子筛的方法纯化了该蛋白,进行了晶体初筛和优化实验,已收集一套3.3A分辨率的X射线衍射数据。 此外,我们还对苏云金芽孢杆菌CrylAa质粒进行了单点突变工作,获得了CrylAa的单点突变蛋白(CrylAa H168R,CrylAa N372G和CrylAa N372A),通过细胞学快速检测方法,获得提高CrylAa杀虫活性的有效方法。
【关键词】：大丽轮枝菌 蛋白质组 低氮限制 分泌蛋白 酿酒酵母 Npc2 重组蛋白 Cry1Aa 杀虫蛋白 单点突变
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一部分 大丽轮枝菌分泌蛋白组学研究12-56
• 第一章 大丽轮枝菌的研究背景12-24
• 1.1 引言12-13
• 1.2 氮信号对植物病原真菌的意义13-14
• 1.3 真菌分泌蛋白的作用14-19
• 1.3.1 激发子蛋白15-16
• 1.3.2 降解植物细胞壁以及消化真菌自己细胞壁的酶类16-18
• 1.3.3 毒素蛋白18-19
• 1.4 宿主植物对大丽轮枝菌病原菌分泌蛋白的响应19-21
• 1.5 植物致病真菌的蛋白组学、分泌蛋白组学研究进展21-24
• 第二章 实验材料、仪器设备与方法24-28
• 2.1 实验材料、试剂与仪器设备24-25
• 2.1.1 菌株与主要试剂24
• 2.1.2 仪器设备24-25
• 2.2 实验方法25-28
• 2.2.1 大丽轮枝菌平台期时间的摸索25
• 2.2.2 大丽轮枝菌的低氮处理25
• 2.2.3 大丽轮枝菌的分泌蛋白提取25
• 2.2.4 大丽轮枝菌的梯度胶电泳25-26
• 2.2.5 大丽轮枝菌分泌蛋白质谱实验的样品前处理及步骤26-27
• 2.2.6 大丽轮枝菌分泌蛋白的筛选和鉴定27-28
• 第三章 结果与讨论28-42
• 3.1 大丽轮枝菌在正常培养条件下和低氮限制条件下的生物量变化28
• 3.2 质谱鉴定的实验结果和二次筛选后的实验结果28-42
• 3.2.1 质谱鉴定的蛋白GO分类功能分析29-31
• 3.2.2 鉴定的低氮条件下诱导的分泌蛋白理化性质分析31-32
• 3.2.3 鉴定的低氮条件下诱导的分泌蛋白功能分析32-40
• 3.2.4 可能的侵入过程40-42
• 本篇小结42-43
• 参考文献43-56
• 第二部分 酿酒酵母Npc2蛋白的结构与功能研究56-84
• 第四章 Npc2蛋白的研究背景56-62
• 4.1 引言56
• 4.2 Npc2基因的鉴定56-57
• 4.3 Npc2蛋白的功能分析57-62
• 4.3.1 酿酒酵母中Npc2蛋白的功能分析58
• 4.3.2 哺乳动物中Npc2蛋白的功能分析及其可能的机制58-62
• 第五章 实验材料、仪器设备与方法62-74
• 5.1 实验材料、试剂与仪器设备62-63
• 5.1.1 质粒、菌株62
• 5.1.2 酶类、其他试剂62
• 5.1.3 仪器设备62-63
• 5.2 实验方法63-74
• 5.2.1 酵母Npc2重组质粒的构建63-67
• 5.2.2 目的蛋白的表达与纯化条件摸索67-70
• 5.2.3 蛋白质晶体的初筛及其优化方法70-74
• 第六章 结果与讨论74-80
• 6.1 Npc2蛋白的表达与纯化74-76
• 6.1.1 Npc2蛋白的表达74
• 6.1.2 Npc2蛋白的纯化74-76
• 6.2 Npc2蛋白的晶体学结果76-78
• 6.2.1 Npc2蛋白晶体的生长与优化条件76-77
• 6.2.2 Npc2衍射数据的收集及结果分析77-78
• 6.3 Npc2蛋白的序列比对分析78-80
• 本篇小结80-81
• 参考文献81-84
• 第三部分 Cry1Aa突变蛋白的功能研究84-106
• 第七章 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的研究背景84-90
• 7.1 引言84
• 7.2 Cry蛋白的结构分析84-90
• 7.2.1 Cry毒素蛋白作用机理85-87
• 7.2.2 影响Cry毒素蛋白杀虫杀虫活性的因素87-88
• 7.2.3 杀虫晶体蛋白应用研究进展88-90
• 第八章 实验材料、仪器设备与方法90-98
• 8.1 实验材料、试剂与仪器设备90
• 8.1.1 质粒、菌株90
• 8.1.2 酶类及其它试剂90
• 8.1.3 仪器设备90
• 8.2 实验方法90-98
• 8.2.1 Cry1Aa单点突变(H168R,N372G,N372A)突变质粒的构建90-95
• 8.2.2 苏云金芽孢杆菌中的蛋白表达条件摸索95-96
• 8.2.3 Cry1Aa突变蛋白的表达条件摸索96
• 8.2.4 Cry1Aa突变蛋白的毒性检测96-98
• 第九章 结果与讨论98-102
• 9.1 Cry1Aa蛋白的纯化结果98-99
• 9.2 Cry1Aa突变蛋白的毒力筛选结果99-101
• 9.2.1 Cry1Aa突变蛋白毒力的昆虫细胞学检测方法的建立99-101
• 9.3 Cry1Ac10蛋白的表达纯化及晶体学结果101-102
• 本篇小结102-103
• 参考文献103-106
• 附录106-114
• 致谢114-116
• 攻读学位期间发表的学术论文、取得的其他研究成果以及参加的学术会议116-117
• 附件117-139

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陶勇;金虹;龙章富;张丽;丁秀琼;陶科;刘世贵;;一株Sanguibacter sp.C4产几丁质酶基因的克隆与表达(英文)[J];遗传学报;2006年11期

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本文编号：259364