四种农业生境昆虫内生放线菌的筛

发布时间：2017-03-21 10:09

  本文关键词：四种农业生境昆虫内生放线菌的筛选、鉴定及抗菌活性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：天然产物(Natual Products)是普遍地存在于整个生态系统的特殊物质,是生物活性物质和实用药物发现的重要源泉,在人类的社会生活中扮演了重要角色。随着抗生素耐药性问题的日益严峻,迫使新药的研发效率急需不断提高。目前,从传统分离源中分离新活性天然产物的几率不断地降低,进而新分离源的探索不断引起研究者的关注。昆虫种类丰富,其分布也极为广泛,几乎遍布地球上的各种生境。昆虫共生微生物的独特活性代谢产物,也引起了研究者们的极大兴趣。其中,昆虫共生放线菌的活性代谢产物研究不断受到研究者的关注。因此,本研究以昆虫纲中第一大目鞘翅目甲虫为分离研究对象,进行内生放线菌多样性研究。将筛选获得的内生放线菌进行新种鉴定和抗病原微生物活性评价,并对活性菌株的活性代谢产物进行分离鉴定,结果如下:(1)从多种昆虫样本中共分离得到内生放线菌41株,通过形态特征、培养特征及部分16S r RNA分析,将这41株菌归类为放线菌的4个属,包括链霉菌属(Streptomyces)27株,小单孢菌属(Micromonospora)11株,链孢囊菌属(Streptosporangium)2株及野野村菌属(Nonomuraea)1株。(2)综合运用多相性分类鉴定方法对菌株NEAU-CX1进行分类学鉴定。通过16S rRNA基因序列分析判断该菌属于小单孢菌属。菌株NEAU-CX1与Micromonospora coxensis JCM13248T(99.3%),Micromonospora purpureochromogenes DSM 43821T(99.1%)和Micromonospora siamensis TT2-4 JCM 12769T(99.1%)的16S r RNA基因序列相似性最高,与小单孢菌属的其它菌株的相似性均低于99%。利用邻位连接法和最大似然法将菌株NEAU-CX1与该属的相关菌株的16S r RNA和gry B基因进行系统发育树构建,分析结果表明,两种方法得到的拓扑结构相同,菌株NEAU-CX1与M.purpureochromogenes DSM 43821T形成独立分支。通过形态特征、生理生化特性、系统分类学及DNA杂交分析确定NEAU-CX1属于小单孢菌属的一个新种,命名为Micromonospora palomenae,保藏在中国科学院微生物研究所和日本理化学研究所微生物菌种保藏中心(=CGMCC 4.7175T=JCM 30056T)。(3)综合运用多相性分类鉴定方法对菌株NEAU-JC6进行分类学鉴定。通过16S rRNA基因序列分析判断该菌属于小单孢菌属。菌株NEAU-JC6与M.haikouensis DSM 45626T(99.3%),M.carbonacea JCM 3139T(99.1%)和M.krabiensis JCM 12869T(99.1%)的16S r RNA基因序列相似性最高,与小单孢菌属其它菌株的相似性均低于98%。利用邻位连接法和最大似然法将菌株NEAU-JC6与该属的相关菌株的16S r RNA和gry B基因进行系统发育树构建,分析结果表明,两种方法得到的拓扑结构相同,菌株NEAU-JC6与M.haikouensis DSM45626T形成独立分支。通过形态特征、生理生化特性、系统分类学及DNA杂交分析确定NEAU-JC6属于小单孢菌属的一个新种,命名为Micromonospora harpali,保藏在中国科学院微生物研究所和日本理化学研究所微生物菌种保藏中心(=CGMCC 4.7173T=JCM 30055T)。(4)综合运用多相性分类鉴定方法对菌株NEAU-FHSN1进行分类学鉴定。通过16S r RNA基因序列分析判断该菌属于链孢囊菌属。菌株NEAU-FHSN1与Streptosporangtum shengliensis NEAU-GH7T(98.7%)的16S r RNA基因序列相似性最高。利用邻位连接法和最大似然法将菌株NEAU-FHSN与该属的相关菌株的16S r RNA基因进行系统发育树构建,分析结果表明,两种方法得到的拓扑结构相同,菌株NEAU-FHSN1与Streptosporangtum roseum JCM 3005T(98.6%),Streptosporangtum vulgare DSM 43802T(98.6%),Streptosporangtum canum HBUM 170018T(98.5%)和Streptosporangtum album DSM 43023T(98.4%)形成一个独立的分枝,与最高相似度菌株S.shengliensis NEAU-GH7T(98.7%)分枝距离较远。通过形态特征、生理生化特性、系统分类学及DNA杂交分析确定NEAU-FHSN1属于链孢囊菌属的一个新种,命名为Streptosporangium lutulentum,保藏在中国科学院微生物研究所和德国不伦瑞克市德国菌种保藏中心(=CGMCC 4.7141T=DSM 46740T)。(5)通过对41株共生放线菌进行生物活性体外测试,得到2株生物活性较好的菌株,分别为C7(NEAU-TLV1)和C24(NEAU-T4),其中C7发酵产物对受试细菌活性较好,C24发酵产物对受试植物病原真菌活性较好。通过对C7和C24的发酵产物进行分离纯化,经鉴定分别得到已知化合物星形孢菌素(Staurosporine)和巴佛洛霉素B1(Bafilomycin B1)。
【关键词】：昆虫内生放线菌 Micromonospora palomenae Micromonospora harpali Streptosporangium lutulentum 多相分类学 活性化合物
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q939.132
【目录】：

• 摘要11-13
• 英文摘要13-16
• 1 前言16-32
• 1.1 昆虫共生微生物的研究现状16-18
• 1.2 昆虫共生微生物与昆虫的关系18-19
• 1.2.1 共生微生物与宿主昆虫的营养18
• 1.2.2 共生微生物与宿主昆虫的防御18-19
• 1.3 昆虫共生放线菌19-30
• 1.3.1 共生放线菌与宿主昆虫的关系19-25
• 1.3.2 昆虫共生放线菌次级代谢产物的研究进展25-30
• 1.4 鞘翅目类昆虫30-31
• 1.5 研究的内容及课题来源31-32
• 1.5.1 研究的目的意义及内容31
• 1.5.2 课题来源31-32
• 2 材料与方法32-48
• 2.1 试验材料32
• 2.1.1 昆虫样品32
• 2.1.2 供试菌株32
• 2.2 试剂与仪器32-33
• 2.2.1 试剂32-33
• 2.2.2 主要仪器33
• 2.3 主要培养基及制备方法33-36
• 2.3.1 分离培养基33-34
• 2.3.2 纯化培养基34
• 2.3.3 发酵培养基34
• 2.3.4 生测培养基34
• 2.3.5 生理生化培养基34-35
• 2.3.6 形态特征观察培养基35-36
• 2.4 昆虫样品内生放线菌的分离与纯化36-37
• 2.4.1 样品采集及前处理36
• 2.4.2 昆虫样品的内生放线菌的分离、纯化36-37
• 2.5 新的稀有放线菌的分类学鉴定37-45
• 2.5.1 形态和培养特征鉴定37
• 2.5.2 生理生化特性鉴定37-39
• 2.5.3 化学分类学鉴定39-42
• 2.5.4 分子水平鉴定42-45
• 2.6 抗菌生物活性检测45-46
• 2.6.1 发酵液预处理45-46
• 2.6.2 发酵液粗提物抗细菌活性检测46
• 2.6.3 发酵液粗提物抗真菌活性检测46
• 2.7 放线菌NEAU-T4和NEAU-TLV1活性代谢产物的分离及鉴定46-48
• 2.7.1 菌体的发酵46
• 2.7.2 内生菌生物活性代谢产物的分离纯化46-47
• 2.7.3 活性化合物的结构鉴定47-48
• 3 结果与分析48-83
• 3.1 昆虫内生放线菌的分离及初步鉴定48-49
• 3.2 菌株NEAU-CX1的多相分类学鉴定结果与分析49-59
• 3.2.1 16S r RNA和Gyr B基因测序及系统发育分析49-50
• 3.2.2 形态及培养特征50-51
• 3.2.3 生理生化特性51-55
• 3.2.4 微生物细胞化学组分分析结果55-57
• 3.2.5 菌株的(G+C)mol%含量57-58
• 3.2.6 DNA同源性分析结果58-59
• 3.3 菌株NEAU-JC6的多相分类学鉴定结果与分析59-68
• 3.3.1 16S r RNA和Gyr B基因测序及系统发育分析59
• 3.3.2 形态及培养特征59-60
• 3.3.3 生理生化特性60-64
• 3.3.4 微生物细胞化学组分分析结果64-66
• 3.3.5 菌株的(G+C)mol%含量66-67
• 3.3.6 DNA同源性分析结果67-68
• 3.4 菌株NEAU-FHSN1的多相分类学鉴定结果与分析68-76
• 3.4.1 16S r RNA基因测序及系统发育分析68
• 3.4.2 形态及培养特征68-70
• 3.4.3 生理生化特性70-72
• 3.4.4 微生物细胞化学组分分析结果72-74
• 3.4.5 菌株的(G+C)mol%含量74-75
• 3.4.6 DNA同源性分析结果75-76
• 3.5 昆虫共生放线菌抑菌活性检测76-78
• 3.5.1 昆虫共生放线菌抗病原细菌活性检测76
• 3.5.2 昆虫共生放线菌抗真菌活性检测76-78
• 3.6 菌株C7和C24的活性评估及代谢产物的分离78-83
• 3.6.1 菌株C7的活性评估及代谢产物的分离78-80
• 3.6.2 菌株C24的活性评估及代谢产物的分离80-83
• 4 讨论83-85
• 4.1 昆虫共生放线菌的研究83
• 4.2 昆虫共生放线菌产生的天然产物研究83-85
• 5 结论85-86
• 5.1 本研究的主要结论85
• 5.2 本研究的主要创新85-86
• 致谢86-87
• 参考文献87-96
• 附录：缩略词简表96-97
• 攻读博士学位期间发表的学术论文97

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