水稻OsOFP转录因子家族基因克隆与功能分析

发布时间：2017-03-21 10:09

  本文关键词：水稻OsOFP转录因子家族基因克隆与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：转录因子(Transcription factor)，也称反式作用因子，能够与基因启动子区的顺式作用元件（cis-acting element）相互作用，从而激活或抑制基因转录，在植物的生长发育、形态建成、抗逆性及次生代谢等方面都起着重要的调控作用。OFP(Ovate Family Proteins)蛋白家族是一类植物所特有的转录因子家族，能够调控植物的生长发育，在拟南芥和番茄中都有关于OFP转录因子功能研究的报道。水稻基因组中含有31个OsOFP转录因子基因家族成员，到目前为止，，对水稻OsOFP家族基因功能的研究报道非常少。 在本研究中，通过生物信息学方法对OsOFP家族的基因结构、蛋白质保守结构域和系统发生进行了分析；利用实时荧光定量PCR技术研究了OsOFP基因的表达模式；利用拟南芥原生质体瞬时转化对OsOFP蛋白进行了亚细胞定位分析。以农杆菌介导法转化水稻，获得了一部分OsOFP家族基因的过量表达的转基因植株。过表达OsOFP22的转基因水稻具有较强的表型，进一步研究了OsOFP22基因的功能。此外，构建了OsOFP22原核表达载体，纯化到该重组蛋白，为全面认识OsOFP22蛋白的性质及深入研究该基因的生物学功能奠定了基础。主要研究结果如下： 1.水稻OsOFP转录因子家族基因生物信息学分析 染色体定位模式图显示，31个OsOFP基因不均等地分布于除了第6和第9以外的其它10条染色体上，且部分基因以串联形式排列；系统发育树显示，AtOFP和OsOFP基因（除了AtOFP17）明显地聚为四大类；对拟南芥、水稻、玉米和高粱OFP转录因子家族基因结构的分析结果表明，大多数OFP基因无内含子，这说明在植物进化过程中OFP家族基因的结构可能发生内含子丢失。OsOFP家族基因编码蛋白质的C端保守性较强，含有保守的OVATE结构域，还预测到未知结构域motif2和motif3。 2.水稻OsOFP转录因子家族基因组织表达及激素响应模式分析 水稻OsOFP家族基因在幼叶、幼根、愈伤组织、胚芽鞘、成熟叶片、颖壳、幼穗和灌浆期种子中的表达具有特异性，而且近半数基因主要在种子发育时期表达量较高，这说明该家族基因可能参与调控水稻生长发育的整个过程，尤其是种子发育过程。利用PlantCARE在线分析了OsOFP家族基因的启动子区序列，结果表明：31个OsOFP基因的启动子区都含有与胚乳和种子发育相关的Skn-1基序，部分基因的启动子区还含有与胚乳和种子发育相关的GCN4基序。 3.水稻OsOFP转录因子家族基因克隆及植物表达载体构建 利用Gateway技术成功地从粳稻品种“日本晴”中克隆了31个OsOFP基因，通过BP反应构建到入门载体pDNOR上，其中16个OsOFP基因通过LR反应构建到转录增强植物表达载体VP64-pCambia1301上，9个OsOFP基因构建到转录抑制植物表达载体EAR-pCambia1301上。 4.水稻OsOFP转录因子家族基因的遗传转化及鉴定 通过农杆菌介导法将10个OsOFP转录增强表达载体和6个OsOFP转录抑制表达载体成功地转化水稻。经过遗传转化筛选和后期多次basta筛选鉴定，总计获得了490多个T0代转基因水稻株系，大部分转基因水稻已获得T1种子，部分转基因水稻已获得T2、T3代种子。 5.水稻OsOFP转录因子家族基因亚细胞定位分析 通过LR反应将构建到入门载体pDNOR上的31个OsOFP基因分别构建到N-端融合黄色荧光蛋白（YFP）报告基因的表达载体上，利用聚乙二醇介导法将亚细胞定位表达载体转化拟南芥叶片原生质体，分析OsOFP蛋白亚细胞定位。定位结果与WOLF PSORT和CELLO在线预测结果大致相同，OsOFP蛋白定位情况可分为两类，一类包含24个OsOFP蛋白，定位于细胞核中；另一类包括7个OsOFP蛋白，主要定位于细胞核中，但在细胞质中也有表达。 6. OsOFP22基因功能的研究 与野生型相比，过表达OsOFP22（OsOFP22-OX）的转基因水稻呈现出茎秆节间短缩、叶片倾角变小、叶片变短变宽、花药形态变短、穗轴变短、茎粗增加、开花时间推迟、籽粒呈短圆型且变厚、变宽；从灌浆期至收获期，叶片叶绿素含量一直明显高于对照野生型的。OsOFP22-OX转基因水稻对GA的敏感性提高，而对BL的敏感性降低，这说明水稻OsOFP22基因可能介导了GA和BR信号传导途径的相互作用。 以农杆菌介导法将构建好的OsOFP22RI-1、OsOFP22RI-2和OsOFP22RI-3的RNAi干扰载体分别转化水稻。通过qRT-PCR分析表明外源导入的OsOFP22RI-1的RNAi片段对OsOFP22基因的转录无抑制作用，而外源导入的OsOFP22RI-2和OsOFP22RI-3降低了OsOFP22基因的转录水平。分析显示，OsOFP22RI转基因水稻的株高、分蘖数、节间、稻谷粒长、稻谷粒宽、稻谷粒厚、稻谷粒重、叶长和叶宽等农艺性状与野生型Kitaake的没有明显差异，这说明该家族基因可能存在着功能冗余。 7.水稻OsOFP22蛋白的原核表达及纯化 构建了OsOFP22原核表达载体，并转化到大肠杆菌Transetta (DE3)菌株中，成功地诱导表达了OsOFP22蛋白。通过Ni-NTAAgarose纯化了OsOFP22蛋白，为全面认识OsOFP22蛋白的性质、寻找与OsOFP22蛋白相结合的顺式作用元件及其调控的下游基因等奠定基础。
【关键词】：水稻 OFP 表达模式 亚细胞定位 过量表达
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 第1章 文献综述16-27
• 1.1 转录因子概述16-21
• 1.1.1 植物转录因子的结构和特点17-18
• 1.1.2 植物转录因子的分类18-19
• 1.1.3 植物转录因子的功能19-20
• 1.1.4 鉴定转录因子功能的方法20-21
• 1.2 转录因子在水稻株型构建中的功能研究21-24
• 1.3 OFP 转录因子研究进展24-25
• 1.4 研究目的和意义25-27
• 第2章 水稻 OsOFP 转录因子家族基因生物信息学分析27-41
• 2.1 实验方法27-28
• 2.1.1 水稻 OsOFP 转录因子家族蛋白的基本性质分析27
• 2.1.2 水稻 OsOFP 转录因子家族基因的染色体定位27
• 2.1.3 OFP 转录因子家族基因的系统进化树构建27
• 2.1.4 OFP 转录因子家族基因的结构分析27-28
• 2.1.5 水稻 OsOFP 转录因子家族基因的氨基酸序列分析28
• 2.1.6 水稻 OsOFP 转录因子家族基因的蛋白保守结构域分析28
• 2.2 结果与分析28-38
• 2.2.1 水稻 OsOFP 转录因子家族基因信息28-29
• 2.2.2 水稻 OsOFP 转录因子家族基因的染色体定位29-30
• 2.2.3 水稻和拟南芥 OFP 转录因子家族基因的系统进化树30-31
• 2.2.4 OFP 转录因子家族基因的结构31-35
• 2.2.5 水稻 OsOFP 转录因子家族基因氨基酸序列分析35-37
• 2.2.6 水稻 OsOFP 转录因子家族蛋白保守结构域的分析37-38
• 2.3 讨论38-39
• 2.4 小结39-41
• 第3章 水稻 OsOFP 转录因子家族基因组织表达及激素响应模式分析41-58
• 3.1 材料与方法41-47
• 3.1.1 实验材料41-42
• 3.1.2 实验方法42-47
• 3.2 结果与分析47-55
• 3.2.1 水稻不同组织 RNA 的提取47-48
• 3.2.2 水稻 OsOFP 转录因子家族基因组织表达模式分析48-50
• 3.2.3 水稻 OsOFP 转录因子家族基因对激素的响应50-53
• 3.2.4 水稻 OsOFP 转录因子家族基因启动子区顺式作用元件的分析53-55
• 3.3 讨论55-56
• 3.4 小结56-58
• 第4章 水稻 OsOFP 转录因子家族基因克隆及植物表达载体构建58-77
• 4.1 材料与方法58-65
• 4.1.1 实验材料58-59
• 4.1.2 实验方法59-65
• 4.2 结果与分析65-74
• 4.2.1 水稻总 RNA 的提取65-66
• 4.2.2 RT-PCR 法扩增水稻 OsOFP 转录因子家族基因66-68
• 4.2.3 OsOFP 基因与入门载体 pDONR 的 BP 重组反应68-72
• 4.2.4 pCambia1301-OsOFP 植物表达载体的构建及农杆菌转化72-74
• 4.3 讨论74-76
• 4.4 小结76-77
• 第5章 水稻OsOFP转录因子家族基因亚细胞定位分析77-89
• 5.1 材料与方法77-80
• 5.1.1 实验材料77-78
• 5.1.2 实验方法78-80
• 5.2 结果与分析80-87
• 5.2.1 水稻 OsOFP 转录因子家族成员亚细胞定位预测80-81
• 5.2.2 GW-pENSG-YFP-OsOFP 亚细胞定位表达载体的构建81-82
• 5.2.3 水稻 OsOFP 转录因子家族的亚细胞定位82-87
• 5.3 讨论87-88
• 5.4 小结88-89
• 第6章 水稻 OsOFP 转录因子家族基因的遗传转化及鉴定89-105
• 6.1 材料与方法89-99
• 6.1.1 实验材料89-95
• 6.1.2 实验方法95-99
• 6.2 结果与分析99-102
• 6.2.1 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化99-100
• 6.2.2 转基因水稻基因组 DNA 鉴定100-101
• 6.2.3 转基因水稻 Western-blot 检测101-102
• 6.3 讨论102-104
• 6.4 小结104-105
• 第7章 水稻 OsOFP22 基因功能研究105-131
• 7.1 材料与方法105-111
• 7.1.1 实验材料105-106
• 7.1.2 实验方法106-111
• 7.2 结果与分析111-128
• 7.2.1 OsOFP22-OX 转基因植株的获得111-114
• 7.2.2 OsOFP22-OX 转基因水稻表型特征及主要农艺性状分析114-123
• 7.2.3 OsOFP22-RNAi 转基因植株的获得与表型分析123-128
• 7.3 讨论128-129
• 7.4 小结129-131
• 第8章 水稻OsOFP22蛋白的原核表达及纯化131-138
• 8.1 材料与方法131-135
• 8.1.1 实验材料131-132
• 8.1.2 实验方法132-135
• 8.2 结果与分析135-136
• 8.2.1 OsOFP22 原核表达载体构建及大肠杆菌 Transetta（DE3）转化135
• 8.2.2 OsOFP22 重组蛋白在原核系统中的表达及纯化135-136
• 8.3 讨论136-137
• 8.4 小结137-138
• 第9章 全文结论与讨论138-142
• 参考文献142-157
• 研究生期间主要研究成果157-159
• 导师简介159-160
• 作者简介160-161
• 致谢161

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郑文静;张燕之;王昌华;赵家铭;李晶;;水稻不同外植体组织培养的差异性及其后代变异的研究[J];安徽农业科学;2008年04期

2 冷语佳;钱前;曾大力;;水稻理想株型的遗传基础研究[J];中国稻米;2014年02期

3 罗赛男,杨国顺,石雪晖,卢向阳,徐萍;转录因子在植物抗逆性上的应用研究[J];湖南农业大学学报(自然科学版);2005年02期

4 黄大年,李敬阳,章善庆,薛锐,杨炜,华志华,谢小波,汪晓玲;用抗除草剂基因快速检测和提高杂交稻纯度的新技术[J];科学通报;1998年01期

5 刘强,赵南明,K.Yamaguch-Shinozaki,K.Shinozaki;DREB转录因子在提高植物抗逆性中的作用[J];科学通报;2000年01期

6 刘强,张贵友,陈受宜;植物转录因子的结构与调控作用[J];科学通报;2000年14期

7 黄泽军,黄荣峰,黄大f ;植物转录因子功能分析方法[J];农业生物技术学报;2002年03期

8 沈革志,张建军,殷丽青,王新其,陈全庆,范昆华;根癌农杆菌介导Ds转座因子的水稻遗传转化[J];上海农业学报;1998年04期

9 李满;大肠杆菌中重组蛋白包含体的形成机制及其影响因素[J];生物工程进展;1992年02期

10 王希庆,陈柏君,印莉萍;植物中的MYB转录因子[J];生物技术通报;2003年02期

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本文编号：259476