大肠杆菌中与核糖体相关的GTP酶EngA的结构与功能研究

发布时间：2017-03-21 23:05

  本文关键词：大肠杆菌中与核糖体相关的GTP酶EngA的结构与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：核糖体是生物体内合成蛋白质的大分子机器。核糖体的组装是一个复杂的过程。这个过程涉及大量功能不同的因子,包括多个ATP依赖的RNA螺旋酶和GTP酶。许多与核糖体相互作用的GTP酶除了参与核糖体组装外,还被认为是细胞调节核糖体组装和多个生长控制通路的耦合点。EngA是细菌中的一个必需的GTP酶。它拥有两个连续的GTP结合结构域,在所有已知的GTP酶中它被单独分为一类。在细菌中,50S核糖体大亚基的成熟需要EngA的存在。但是,EngA在细胞内的作用机制目前还不十分清楚。本论文采用生物化学方法、电子显微学和单颗粒三维重构技术研究了EngA蛋白和核糖体大亚基结合的复合物的结构以及它们的相互作用。本论文得到EngA蛋白和核糖体大亚基在GMPPNP和GDP两种核酸状态下的冷冻电镜结构。这两个结构显示EngA在两个不同的核酸状态在核糖体大亚基上有两个不同的结合位点,这两个结合位点分别是核糖体大亚基上的两个功能中心。当存在GTP的类似物GMPPNP的条件下,EngA结合在核糖体大亚基上的多肽转移酶活性中心,并使23S rRNA发生了巨大的构象变化。它使核糖体大亚基的构象变得很像核糖体大亚基组装过程晚期的中间体。同时,在EngA-50S-GMPPNP复合体中,EngA的两个GTP结合结构域为假二次对称结构。当存在GDP的条件下,EngA结合在核糖体大亚基的多肽链出口的位置,该位置与许多新生肽链结合因子在核糖体上的结合位点是重合的。本论文还用生物化学方法研究了EngA蛋白和成熟核糖体大亚基的相互作用。研究显示在成熟的核糖体大亚基存在的条件下,EngA的GTP酶活性增强。这有可能是通过使EngA的两个GTP结合结构域发生结构重排达到的。最后,本论文研究了EngA蛋白和两种不成熟的核糖体大亚基的相互作用。研究发现EngA蛋白和△rrm J菌株中不成熟的核糖体大亚基的结合效率较高。这些研究表明某种特定构象的不成熟的核糖体大亚基有可能是EngA作用的真正底物。本论文提供了EngA与核糖体大亚基相互作用的重要的结构信息,并对EngA的功能进行了一定研究,对于最终揭示EngA的作用机制具有非常重要的意义。
【关键词】：EngA Der YphC 核糖体组装 GTP酶
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 主要符号对照表6-10
• 第1章 引言10-35
• 1.1 核糖体10-15
• 1.1.1 核糖体概述10
• 1.1.2 核糖体的研究历史10-11
• 1.1.3 核糖体的结构11-13
• 1.1.4 核糖体的功能13-15
• 1.2 核糖体的组装过程15-23
• 1.2.1 rRNA的转录15-18
• 1.2.2 rRNA的修饰18
• 1.2.3 核糖体蛋白的修饰18-19
• 1.2.4 核糖体亚基的组装19-23
• 1.3 核糖体组装相关因子23-24
• 1.4 核糖体组装相关GTP酶24-27
• 1.4.1 Era24-25
• 1.4.2 RsgA25-26
• 1.4.3 ObgE26
• 1.4.4 YihA26-27
• 1.5 ENGA27-31
• 1.5.1 概述27
• 1.5.2 EngA的结构27-29
• 1.5.3 EngA的两个GTP结合结构域29
• 1.5.4 EngA的功能29-31
• 1.6 电子显微学31-33
• 1.6.1 电子显微镜的简介31-32
• 1.6.2 单颗粒三维重构的基本原理32-33
• 1.6.3 单颗粒三维重构的新进展33
• 1.7 本研究的意义33-35
• 第2章 EngA与核糖体复合物的结构研究35-70
• 2.1 材料与方法35-48
• 2.1.1 实验仪器35-36
• 2.1.2 化学试剂36
• 2.1.3 宿主和载体36
• 2.1.4 野生型EngA以及各突变体的表达纯化36-37
• 2.1.5 大肠杆菌核糖体的提取37-39
• 2.1.6 共沉淀实验39
• 2.1.7 电子显微镜样品制备39-40
• 2.1.8 镀碳膜40-41
• 2.1.9 冷冻样品制样过程41-42
• 2.1.10 用电子显微镜收集数据42-44
• 2.1.11 数据的三维重构44-45
• 2.1.12 原子模型搭建45
• 2.1.13 EngA突变体的构建45-48
• 2.2 实验结果48-69
• 2.2.1 大肠杆菌EngA蛋白的表达与纯化48-50
• 2.2.2 50S核糖体的提取50-52
• 2.2.3 EngA与 50S核糖体的结合52-53
• 2.2.4 50S?EngA?GMPPNP复合物的结构特征53-59
• 2.2.5 50S?EngA?GDP复合物的结构特征59-65
• 2.2.6 用生物化学方法验证EngA和 50S复合物的结构65-69
• 2.3 本章小结69-70
• 第3章 EngA与成熟核糖体大亚基的相互作用70-85
• 3.1 实验材料与方法70-78
• 3.1.1 实验材料70
• 3.1.2 体外翻译实验70
• 3.1.3 70S核糖体拆分实验70-71
• 3.1.4 EngA的定点突变和截短71-76
• 3.1.5 GTP酶活性检测76-78
• 3.2 实验结果78-84
• 3.2.1 加入EngA使体外翻译系统的翻译效率降低78-80
• 3.2.2 EngA不拆分 70S核糖体80-81
• 3.2.3 his-tag对EngA的影响81-82
• 3.2.4 50S核糖体使EngA的GTP酶活性增强82-83
• 3.2.5 EngA的两个GTP结合结构域的GTP酶活性的研究83-84
• 3.3 本章小结84-85
• 第4章 EngA与不成熟核糖体大亚基的相互作用85-97
• 4.1 实验材料与方法85-89
• 4.1.1 实验材料85
• 4.1.2 YM01菌株不成熟核糖体大亚基的提取85-86
• 4.1.3 BW25113菌株上rrmJ基因的敲除86-87
• 4.1.4 △rrmJ菌株不成熟核糖体大亚基的提取87-88
• 4.1.5 Spot assay88
• 4.1.6 Ribosome profile88-89
• 4.2 结果与讨论89-96
• 4.2.1 EngA与枯草芽孢杆菌YM01菌株中不成熟核糖体大亚基的相互作用89-90
• 4.2.2 EngA与大肠杆菌△rrmJ菌株中不成熟核糖体大亚基的相互作用90-96
• 4.3 本章小结96-97
• 第5章 讨论与展望97-103
• 5.1 讨论97-101
• 5.1.1 EngA在GAD家族中是一个单独的成员97-99
• 5.1.2 EngA在核糖体组装过程中的作用99-100
• 5.1.3 EngA有可能在胁迫条件下调节细胞生长100-101
• 5.2 展望101-103
• 参考文献103-115
• 致谢115-117
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果117

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