基于SILAC技术的PRRSV感染Marc-145细胞分泌蛋白质组学研究

发布时间：2020-05-08 06:03

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的造成全球养猪业严重危害的病毒性传染病,主要临床表现为妊娠母猪明显的繁殖障碍以及仔猪严重的呼吸系统症状和生长迟缓。自1987年首次在北美发现以来,目前已扩散至全球各大养猪国,并造成了巨大的经济损失,也成为我国重要的地方流行性疾病之一。目前已知PRRSV诱导炎症因子的大量表达和释放某些蛋白质参与免疫炎症反应,例如PRRSV感染Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(PAMs)能诱导高迁移率族蛋白1(HMGB1)的释放,且能增强PRRSV诱导的炎症反应。这提示我们细胞外分泌蛋白也在PRRSV的致病机理中发挥很重要的作用。但目前研究都仅基于对个别已知分泌蛋白的分析,无法对未知分泌蛋白进行分析且缺乏整体性。本研究利用蛋白质组学技术分析了PRRSV感染Marc-145细胞和未感染状态下分泌蛋白图谱的差异,通过生物信息学手段对差异蛋白表达谱进行分析并在功能上验证差异蛋白PRDX3的促炎性因子作用和增强PRRSV诱导炎症反应的作用。具体研究内容如下:1.PRRSV感染Marc-145细胞的分泌蛋白质组学研究利用细胞培养稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell cultures,SILAC)技术,配合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),对PRRSV感染Marc-145细胞的分泌蛋白表达情况进行了定量检测和分析。共鉴定出204个差异表达蛋白,包括163个表达上调的蛋白和41个表达下调的蛋白。随后利用生物信息学技术对差异表达分泌蛋白的亚细胞定位、生物学功能进行了分析,并绘制了互作网络图,发现PRRSV感染显著激活了非经典分泌途径,特别是Exosome介导途径,例如各种DAMPs的释放。生物学功能分析发现差异表达的蛋白与蛋白结合和转运、应激反应调控、代谢过程和免疫反应等多种生物过程相关。为了验证分泌蛋白质组学结果的可靠性,进一步通过Western blot方法对结果中的4个差异表达的蛋白进行了检测,结果与蛋白质组学结果一致。2.PRDX3诱导炎症因子的表达过氧化物酶(peroxiredoxins,Prxs)是一类很重要的内源性抗氧化剂。已有报道显示,细胞外的PRDX1作为促炎性因子与TLR4结合,激活NF-κB,促进TNF-α和IL-6的分泌。本研究中,我们发现PRRSV感染后促进了PRDX3的分泌,继而对其可能的促炎性因子作用进行了研究。首先原核表达和纯化PRDX3,随后处理PK-15细胞,通过NF-κB荧光素酶报告系统、Western blot实验、间接免疫荧光和相对定量PCR发现,PRDX3可以诱导NF-κB的激活、NF-κB p65亚基的磷酸化和入核、IL-6,IL-8和TNF-α等炎症因子的表达,说明PRDX3具有促炎性因子的作用。为了探讨TLR4是否参与PRDX3诱导的炎症反应,将TLR4干扰分子转染PK-15细胞后用PRDX3蛋白处理,通过Real-time PCR检测发现干扰TLR4的表达能抑制PRDX3诱导的IL-6,IL-8和TNF-α等炎症因子的表达。此外,利用PRDX3处理TLR4缺失的HEK-293T细胞则不能诱导NF-κB的激活,而在转染了TLR4超表达质粒的HEK-293T细胞上PRDX3可以诱导NF-κB的激活。以上结果提示TLR4参与PRDX3诱导的炎症反应。3.PRDX3参与PRRSV诱导的NF-κB激活和炎症因子的表达首先,利用间接免疫荧光检测发现PRRSV感染Marc-145细胞后,不能改变PRDX3的线粒体定位。随后采用Western blot检测发现PRRSV感染能诱导细胞上清中PRDX3的表达,而胞内PRDX3则略微下调。由于PRRSV感染显著激活了Exosome介导的蛋白分泌途径和会引起细胞线粒体损伤,溶解,我们推测Exosome在PRRSV诱导PRDX3的分泌中具有重要的作用。随后,我们检测发现PRDX3不影响PRRSV的增殖。但将纯化的PRDX3蛋白处理Marc-145细胞,通过Real-time PCR检测发现胞外PRDX3能上调PRRSV诱导的IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达。将PRDX3干扰分子转染Marc-145细胞后接种PRRSV,干扰内源性的PRDX3促进PRRSV诱导的IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子的表达,推测胞内的PRDX3可能通过其过氧化物酶活性影响ROS介导的炎症反应。以上结果提示胞内和胞外的PRDX3在PRRSV诱导的炎症反应中扮演重要角色。
【图文】：

非经典,经典

华中农业大学 2016 届博士研究生学位论文研究（galectin-1）(Cooper and Barondes 1990)发现并建立起来的。此后，通过非途径分泌的蛋白已包括到激素、生长因子、细胞因子、趋化因子、病毒蛋白质生虫蛋白质。研究者至少发现了 4 种形式的非经典分泌途径(Koomen et al 200种形式的非经典分泌途径是将目的蛋白转运到各种类型的囊泡中，包括内吞作分泌溶酶体（endocytic secretory lysosomes）（图 1-1B，步骤 2）、衍生出外泌体exosome）的多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）（图 1-1B，步骤 3）和从表面分离的各种微泡（microvesicles）（图 1-1B，步骤 4）。还有一种非经典分泌是不通过囊泡的而是直接转运细胞质蛋白到细胞质膜（图 1-1B，步骤 5），例如原细胞生长因子（FGF-2）的分泌就是不通过运输小泡，直接跨膜外运到胞外一种被动扩散的过程(Seelenmeyer et al 2008)。

生物学软件,预测软件,信号肽,蛋白质芯片

除了以上介绍的分泌蛋白样品制备和分离鉴定技术外，各种生物学软件也蛋白质组的研究提供了非常好的工具，大大加速了分泌蛋白质组的研究。蛋以通过这些生物学软件，例如常用信号肽预测软件 SignalP(Bendtsen et al 2004SORT(Hiller et al 2004a)、TargetP 和跨膜区预测软件 TMHMM 等，对其信号肽区进行分析可以确定备选的分泌蛋白。SecretomeP 除了可以准确的预测含有的经典分泌蛋白，也可以预测不含有信号肽的非经典分泌的蛋白质(Bendtsen 004a)。利用分泌蛋白质组学技术鉴定或生物学软件预测到的分泌蛋白后，可白质印迹法（Western blot）、免疫组化（Immunohistochemistry）、间接免疫疫荧光（Immunofluorescence technique）等技术对分泌蛋白的定位和功能进行研外还有可以采用酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）、GST-pull-down ass疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）及蛋白质芯片（protein chip）等蛋白质的相互作用进行研究，，为分泌蛋白质组学的结果提供更好的验证。图 1-2 分泌蛋白质组研究策略(Deshmukh et al 2015)Fig. 1-2 Research strategy for secretome
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.651

【参考文献】