提高体外成熟卵母细胞质量研究：抑制GVBD的后作用及体外成熟系统优化

发布时间：2017-03-25 20:03

  本文关键词：提高体外成熟卵母细胞质量研究：抑制GVBD的后作用及体外成熟系统优化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：PARTI:通过抑制卵母细胞GVBD,增加胞质成熟时间来提高体外成熟卵母细胞质量的方法很少有成功的,主要由于缺乏对GVBD抑制期间发生分子事件了解。这方面的报道对研究卵母细胞GV期间基因表达调控也有重要借鉴意义。我们研究了不同物种间GVBD抑制对减数分裂进程后作用,以及涉及信号通路。我们证明,ROS抑制以后,小鼠卵母细胞减数分裂进程变慢,猪卵母细胞减数分裂进程变快。抑制期间,猪卵母细胞Cyclin B量逐渐增加,而小鼠卵母细胞Cyclin B量先降低后缓慢升高。在小鼠和猪上,(a)有活性CDC2A变化和Cyclin B变化类似,无活性CDC2A都是逐渐减少；(b)抑制期间添加CHX后,Cyclin B和有活性CDC2A都降低到最低,卵母细胞减数分裂进程显著变慢；(c)抑制期间添加钒酸钠使卵母细胞减数分裂进程变慢,添加EGF使进程加快,但都不影响Cyclin B变化。因此,ROS抑制卵母细胞3VBD期间,EGF能促进前MPF向MPF转化,加速减数分裂进程。小鼠和猪卵母细胞抑制后减数分裂进程不同主要由于Cyclin B变化不同造成的,在前MPF向MPF转化和EGF信号通路方面没有差异。PART II:大鼠卵母细胞具有自发激活的特性,使大鼠体细胞核移植克隆非常困难,体外成熟卵母细胞自发激活比例显著低于体内成熟卵母细胞。关于大鼠卵母细胞研究主要集中在体内,不管是孤雌激活后发育还是体外受精后发育,关于体外成熟卵母细胞的研究很少,受精后有活体出生的报道更少。我们以成熟199为培养液,添加胱氨酸半胱胺,并且与卵丘共培养后显著改善体外成熟卵母细胞质量。卵母细胞孤雌激活和体外受精后发育能力都达到体内成熟卵母细胞水平,将得到2-Cell胚胎移植后,胎儿出生率与体内组无显著差异。改善体外培养条件后,卵母细胞核进程和皮质颗粒分布变化与体内组更相近；卵母细胞抵抗氧化应激能力提高,ROS水平降低,GSH含量提高；促进发育相关基因表达,最终显著改善卵母细胞胞质成熟质量。因此,我们建立一个比较好的大鼠体外成熟系统,为将来进一步研究大鼠体外成熟卵母细胞特性及应用奠定了很好基础。
【关键词】：卵母细胞 GVBD 后作用 MPF 体外成熟 氧化应激
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q492
【目录】：

• 中文摘要10-11
• Abstract11-13
• PARTⅠ 卵母细胞GVBD抑制对减数分裂进程后作用13-39
• 1 前言13-25
• 1.1 减数分裂恢复调控13-17
• 1.1.1 MPF与减数分裂13-15
• 1.1.2 MAPK与减数分裂15-17
• 1.2 不同抑制剂抑制减数分裂恢复17-20
• 1.2.1 蛋白磷酸化抑制剂17-18
• 1.2.2 蛋白质合成抑制剂CHX18-19
• 1.2.3 提高卵母细胞内cAMP水平19-20
• 1.3 抑制减数分裂恢复对卵母细胞影响20-23
• 1.3.1 核进程变化20-21
• 1.3.2 蛋白和mRNA变化21-23
• 1.4 EGF对减数分裂作用23
• 1.5 本文主要研究内容23-25
• 2 材料与方法25-28
• 2.1 主要试剂及配制25-26
• 2.2 实验动物饲养及处理26
• 2.3 小鼠和猪卵母细胞收集26
• 2.4 卵母细胞体外培养26
• 2.5 减数分裂进程观察26-27
• 2.6 Western杂交27
• 2.7 抗体选择27
• 2.8 数据分析27-28
• 3 结果28-35
• 3.1 ROS抑制后,加速猪卵母细胞减数分裂进程,减缓小鼠卵母细胞减数分裂进程28-29
• 3.2 Western blot分析小鼠和猪卵母细胞抑制后cyclin B,总CDC2A,无活性和有活性P-CDC2A变化】29-30
• 3.3 抑制期间MPF组分变化与减数分裂进程的关系30-31
• 3.4 抑制过程中添加钒酸钠减慢小鼠和猪卵母细胞减数分裂进程31-33
• 3.5 抑制期间通过添加EGF促进前MPF向MPF转化加速小鼠和猪卵母细胞减数分裂进程33
• 3.6 抑制期间EGF对小鼠和猪卵母细胞cyclin B,无活性和有活性P-CDC2A影响33-35
• 4 讨论35-38
• 4.1 抑制过程中cyclin B蛋白变化35
• 4.2 抑制过程中前MPF向MPF转化35-36
• 4.3 抑制过程中添加EGF作用36-38
• 5 结论38-39
• PARTⅡ大鼠卵母细胞体外成熟系统优化39-71
• 1 前言39-54
• 1.1 大鼠卵母细胞自发激活39-41
• 1.1.1 自发激活的影响因素40
• 1.1.2 自发激活的判定标准40-41
• 1.1.3 抑制大鼠卵母细胞自发激活的方法41
• 1.1.4 自发激活对胚胎发育及核移植克隆的影响41
• 1.2 卵母细胞体外成熟41-43
• 1.2.1 细胞质成熟和核成熟42
• 1.2.2 卵母细胞体外成熟42-43
• 1.3 影响体外培养成熟的因素43-46
• 1.3.1 体外成熟的培养液43
• 1.3.2 卵丘细胞的影响43-44
• 1.3.3 氧化应激对卵母细胞体外成熟的影响44
• 1.3.4 卵泡直径与卵母细胞直径对卵母细胞体外成熟的影响44-45
• 1.3.5 动物年龄的影响45-46
• 1.4 提高体外成熟的卵母细胞的质量方法46-49
• 1.4.1 抑制体外自发成熟46-47
• 1.4.2 卵丘共培养47-48
• 1.4.3 添加胱氨酸/半胱胺48-49
• 1.4.4 添加外源性卵分泌生长因子49
• 1.5 卵母细胞体外成熟质量的检测指标49-53
• 1.5.1 卵母细胞的形态学检测49-50
• 1.5.2 减数分裂进程与卵母细胞体外成熟50
• 1.5.3 卵母细胞内细胞器检测50-51
• 1.5.4 体外胚胎发育51-52
• 1.5.5 卵母细胞胞质中谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平52
• 1.5.6 发育相关基因检测52-53
• 1.6 本文主要研究内容53-54
• 2 材料与方法54-59
• 2.1 主要试剂及配制54
• 2.2 实验动物及卵母细胞获取54-55
• 2.3 卵母细胞体外成熟培养55
• 2.4 卵母细胞孤雌激活及胚胎培养55
• 2.5 卵母细胞体外受精55-56
• 2.6 卵母细胞自发激活判定56
• 2.7 胚胎移植56
• 2.7.1 制作不育雄鼠的输精管切除术56
• 2.7.2 受体母鼠准备及胚胎移植56
• 2.8 核进程观察56-57
• 2.9 皮质颗粒染色57
• 2.10 卵母细胞内ROS水平的检测57
• 2.11 GSH水平检测57-58
• 2.12 发育相关基因检测58
• 2.13 数据分析58-59
• 3 结果59-67
• 3.1 不同成熟条件对卵母细胞核进程影响59
• 3.2 不同成熟条件对卵母细胞自发激活影响59-60
• 3.3 不同成熟条件对卵母细胞孤雌激活后胚胎发育影响60-61
• 3.4 不同成熟条件对卵母细胞体外受精后胚胎发育影响61-62
• 3.4.1 体外受精时获能液摸索61
• 3.4.2 体外受精时获能时间确定61-62
• 3.4.3 不同成熟条件对大鼠体外受精后胚胎发育能力影响62
• 3.5 不同成熟条件对胚胎着床后发育影响62-63
• 3.6 不同成熟条件对卵母细胞ROS水平影响63
• 3.7 不同成熟条件对卵母细胞谷胱甘肽水平影响63-64
• 3.8 不同成熟条件对卵母细胞成熟过程中皮质颗粒分布影响64-65
• 3.9 不同成熟条件对发育相关基因表达的影响65-67
• 4 讨论67-70
• 4.1 添加胱氨酸、半胱胺及卵丘共培养对胞质成熟影响67
• 4.2 大鼠卵母细胞体外成熟后胚胎移植67-68
• 4.3 胞质成熟相关指标68-69
• 4.4 大鼠体外受精条件优化69-70
• 5 结论70-71
• References of part Ⅰ71-82
• References of part Ⅱ82-96
• 致谢96-97
• Publication List97

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李晓晨;;卵母细胞冷冻保存研究进展[J];上海畜牧兽医通讯;2007年02期

2 彭礼繁;Eun-A LIM;Tae-Saeng CHOI;罗光彬;;小鼠体内卵母细胞死亡的形态变化研究[J];广东畜牧兽医科技;2008年02期

3 徐盛玉;吴德;王定越;;卵母细胞质量评定方法[J];中国生物工程杂志;2008年07期

4 谭景和;秦鹏春;;猪排卵后卵母细胞老化过程的超微结构研究[J];东北农学院学报;1983年01期

5 赵志勇;卵母细胞减数分裂的抑制与启动的生化机理[J];动物学杂志;1988年04期

6 刘燕杰;孙雪萍;汪劲能;丁家桐;;卵母细胞激活的信号机制[J];畜牧兽医杂志;2007年01期

7 徐飞良;肖兵南;胡兴旺;李剑波;燕海峰;张健;;几个猪卵母细胞体外培养和受精的影响[J];湖南师范大学自然科学学报;2007年01期

8 王建英;万发春;孟小倩;张秀美;;哺乳动物卵母细胞老化的研究进展[J];动物学杂志;2009年02期

9 包华琼;;卵母细胞冷冻保存损伤机制的研究进展[J];生物技术通报;2009年S1期

10 叶小芳;陈静波;黄俊成;;抗氧化剂延缓卵母细胞老化[J];细胞生物学杂志;2009年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 李向臣;姚雅馨;赵倩君;浦亚斌;王义鹏;关伟军;马月辉;;玻璃化冷冻对卵母细胞纺锤体分布的影响[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年

2 戴建军;吴彩凤;张廷宇;张树山;徐利;张德福;;三种冷冻方法对猪MⅡ期卵母细胞线粒体分布和损伤的影响[A];上海市制冷学会2013年学术年会论文集[C];2013年

3 刘姗;陈子江;李媛;高选;杨慧军;颜军昊;;线粒体分布变化与人卵母细胞体外成熟的关系初探[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年

4 王磊;司远彬;邵小光;;卵母细胞成熟障碍患者分析[A];中华医学会第十次全国妇产科学术会议妇科内分泌会场（妇科内分泌学组、绝经学组、计划生育学组）论文汇编[C];2012年

5 王实;朴海仙;吴俊波;金一;;卵母细胞凋亡途径及调控因子的研究现状[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（下册）[C];2010年

6 王松波;宁刚;陈秀芬;欧阳宏;夏国良;;磷酸二脂酶5(PDE5)抑制剂zaprinast对小鼠卵母细胞自发成熟的影响[A];全国动物生理生化第九次学术交流会论文摘要汇编[C];2006年

7 金帆;;卵母细胞的体外成熟[A];浙江省中西医结合学会生殖医学专业委员会第八次学术年会暨国家级继续教育学习班资料汇编[C];2008年

8 金帆;;卵母细胞的体外成熟[A];浙江省中西医结合学会生殖医学专业委员会第七次学术年会暨国家级继续教育学习班资料汇编[C];2007年

9 禹学礼;栗颖华;邓雯;孟雨;;牛腔前卵泡卵母细胞体外受精研究[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年

10 史中娜;陈雯;;卵母细胞胞质内空泡对胚胎发育的影响[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 刘霞;美实验证实人类存在卵原干细胞[N];科技日报;2012年

2 记者 许琦敏;出生后卵母细胞还能不断产生[N];文汇报;2009年

3 杨淑娟;美发现近期骨髓细胞不能形成卵母细胞[N];中国医药报;2006年

4 美讯;使用冷冻卵母细胞可能降低体外受精成功率[N];医药经济报;2006年

5 记者 何德功;日本用卵母细胞成功培育出幼鼠[N];新华每日电讯;2004年

6 记者 刘霞;雌性老鼠出生后仍产卵母细胞[N];科技日报;2009年

7 ;人卵母细胞的低温贮藏[N];中国医药报;2003年

8 记者 王丹 通讯员 魏书明 仰东萍;单个卵母细胞高精度全基因测序完成[N];健康报;2013年

9 付东红 马凤琴;我国第一个“三冻”男婴诞生[N];健康报;2006年

10 刘涛 董奇光;我省成功实施首例冻融卵母细胞试管婴儿手术[N];太原日报;2012年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘雪青;LH诱导小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中相关调控网络的研究[D];西北农林科技大学;2015年

2 刘帅;猪卵胞质注射及单精子胞质内注射介导的转基因方法研究[D];广西大学;2015年

3 任亮;猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻的研究[D];东北农业大学;2015年

4 马汝钧;Rab蛋白在卵母细胞减数分裂过程中的作用[D];南京农业大学;2014年

5 刘美菊;白藜芦醇在高龄小鼠和人卵母细胞成熟中的作用研究[D];山东大学;2016年

6 焦光忠;提高体外成熟卵母细胞质量研究：抑制GVBD的后作用及体外成熟系统优化[D];山东农业大学;2015年

7 李海军;牛卵丘—卵母细胞复合体凋亡发生和调控与其发育潜能关系研究[D];内蒙古大学;2008年

8 李青;葡萄糖抑制小鼠卵母细胞老化的机理及小鼠卵母细胞的体外保存[D];山东农业大学;2012年

9 刘娜;丙酮酸调控小鼠卵母细胞排卵后老化的研究[D];山东农业大学;2008年

10 陶勇;一氧化氮与猪卵母细胞减数分裂成熟[D];中国农业大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 周洪彬;卵母细胞成熟抑制剂对猪卵母细胞成熟的影响[D];西南大学;2006年

2 卢晓丽;镉抑制卵母细胞MI期进程中MPF的活性及其相关基因的表达[D];福建医科大学;2015年

3 沈江鹏;不同形态卵母细胞与不同浓度精子组合对受精及早期胚胎发育的影响[D];内蒙古大学;2015年

4 张光利;小鼠死后滞留对卵巢卵母细胞存活与成熟的影响[D];河北联合大学;2014年

5 程立立;卵母细胞分泌因子在人MⅡ卵母细胞的卵丘颗粒细胞中的表达及其与卵母细胞发育潜能关系的研究[D];河北医科大学;2015年

6 岑文;猪卵母细胞体外成熟培养及孤雌胚胎体外培养的研究[D];陕西师范大学;2015年

7 邵丽;卵母细胞体外成熟过程中卵丘细胞上基因表达谱变化及其生物学意义[D];南京医科大学;2015年

8 木尔扎提·阿勒腾别克;绵羊磷脂酶C zeta(PLCζ)对绵羊卵母细胞的激活作用及早期胚胎发育的影响[D];石河子大学;2015年

9 林秀娇;Nlrp9b在小鼠早期胚胎发育中的表达、定位及功能[D];福建农林大学;2015年

10 郭晓英;不同培养因素对犬IVM卵母细胞形态和发育能力的影响[D];延边大学;2010年

  本文关键词：提高体外成熟卵母细胞质量研究：抑制GVBD的后作用及体外成熟系统优化，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：267684