mTOR信号途径调节间充质干细胞免疫调控能力的作用及机制研究

发布时间：2017-03-28 00:02

  本文关键词：mTOR信号途径调节间充质干细胞免疫调控能力的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是存在于骨髓和其他多种组织中的成体干细胞。MSCs具有广泛的免疫调控作用,目前已在临床上应用于移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)和自身免疫性疾病等的治疗。慢性GVHD (chronic GVHD, cGVHD)是影响异基因造血干细胞移植(]hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)效果的主要并发症,其临床表现与多种自身免疫性疾病类似。有研究报道MSCs在部分自身免疫性疾病中存在衰老、凋亡和增殖能力减弱等现象,可能参与了疾病的发病过程。cGVHD患者MSCs是否也有类似现象,能否用自体MSCs进行细胞治疗尚不明确。 MSCs发挥免疫调控作用需要炎性微环境的激活。然而,在炎性细胞因子作用下,MSCs出现损伤并增加免疫原性,限制了其在GVHD等多种疾病中的治疗作用。mTOR信号途径参与调控多种免疫反应,对T细胞、B细胞激活和分化等具有重要的调控作用。另外,mTOR信号途径还参与调控B16黑色素瘤细胞等表面MHC分子的表达。然而,在MSCs中mTOR信号途径是否能调节免疫抑制能力和免疫原性尚不清楚。 本研究旨在阐明MSCs在cGVHD发生发展中的作用,并探讨自体MSCs治疗cGV HD的可行性；探讨mTOR信号途径对MSCs免疫抑制能力和免疫原性的调节作用及具体机制,为改善MSCs治疗GVHD等疾病奠定实验基础。 第一章慢性移植物抗宿主病患者骨髓间充质干细胞生物学特性研究 目的：比较分析HSCT后cGVHD患者和无cGVHD患者骨髓MSCs的表型和功能,阐明MSCs在cGVHD发生发展中的作用；进一步与正常供者骨髓MSCs比较,探讨cGVHD患者MSCs用于自体移植的可行性。 方法：分离培养25例异基因HSCT后cGVHD患者,16例无cGVHD患者和19例正常供者的骨髓MSCs,取第3-5代细胞进行比较分析。短串联重复序列(STR)-PCR检测HSCT后骨髓MSCs来源；成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)培养法检测MSCs在骨髓中的数量；流式细胞术检测细胞表面标记、凋亡和免疫抑制能力；茜素红染色和油红O染色分别检测MSCs成骨和成脂分化能力；衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老；ELISA检测MSCs正常培养和与外周血单个核细胞(PBMCs)共培养后免疫抑制因子分泌水平；荧光定量PCR检测多能性相关基因、衰老相关基因和分化相关基因表达水平；Transwell实验检测MSCs迁移能力。 结果：HSCT后cGVHD患者和无cGVHD患者骨髓MSCs都来自患者自身。MSCs表面都强表达CD73、 CD90、 CD105,中等表达HLA-ABC,不表达CD34、 CD45、 CD11b、 CD19和HLA-DR。两组MSCs在骨髓中的数量相当,具有相似的细胞形态、增殖和自我更新能力、分化潜能和迁移能力。MSCs的细胞衰老和凋亡百分比也无明显差异。两组MSCs的免疫抑制能力无明显区别,都能显著抑制植物凝集素(PHA)活化的PBMCs增殖；与CD4+T细胞单独培养相比,MSCs与CD4+T细胞共培养后,能明显增加CD4+CD25hiCD127-Tregs的比例；MSCs正常培养或与PBMCs共培养后免疫抑制因子TGF-p1、 IL-10、 HGF、 PGE2的分泌水平也类似。另外,与正常供者骨髓MSCs相比,尽管cGVHD组MSCs在骨髓中的数量减少,而在表型和其他功能方面均无显著差别。 结论：MSCs不参与cGVI ID的发生发展,cGVHD患者MSCs具有正常的表型和功能,可能适用于自体细胞治疗。 第二章nTOR信号途径调节骨髓间充质干细胞免疫抑制能力的作用及机制 目的：阐明mTOR信号途径对骨髓MSCs免疫抑制能力的调节作用及其机制。 方法：MSCs预处理不同浓度雷帕霉素后与活化的PBMCs、小鼠脾细胞以及CD4+T细胞共培养5天,流式细胞术分别检测PBMCs、小鼠脾细胞增殖率和CD4+CD25hiCD127-细胞比例。荧光定量PCR检测IFN-γ、 TNF-a受体和免疫抑制因子mRNA表达水平；Western blotting检测COX-2、 mPGES-1等蛋白表达水平；慢病毒介导的shRNA干扰验证COX-2在MSCs免疫抑制中的作用；ELISA检测雷帕霉素预处理后MSCs培养上清PGE2的分泌水平。 结果：雷帕霉素预处理抑制mTOR信号途径后显著增强MSCs对PBMCs增殖的抑制作用,对诱导Tregs作用没有明显影响。雷帕霉素预处理后,MSCs也能明显抑制抗CD3/CD28抗体活化的小鼠脾细胞增殖。抑制mTOR信号途径不影响炎性细胞因子IFN-γ、 TNF-a受体的表达,但能显著提高COX-2的mRNA和蛋白水平以及PGE2分泌水平。IFN-γ、 TNF-a也增强COX-2和PGE2的表达,雷帕霉素预处理后能在炎性细胞因子作用基础上进一步上调。加入COX-2特异性抑制剂NS-398或shRNA干扰后能减弱雷帕霉素对MSCs免疫抑制的促进作用。雷帕霉素引起MSCs中NF-κB入核,加入NF-κB抑制剂PDTC后雷帕霉素对COX-2蛋白表达的上调作用减弱。 结论：雷帕霉素预处理抑制mTOR信号途径后通过上调MSCs的COX-2和PGE2表达增强免疫抑制作用。 第三章mTOR信号途径调节骨髓间充质干细胞免疫原性的作用 目的：阐明mTOR信号途径对骨髓MSCs表面HLA-ABC和HLA-DR表达的调节作用。 方法：雷帕霉素预处理MSCs,正常培养或IFN--γ作用不同时间后流式细胞术检测细胞表面HLA-ABC+、HLA-D R+细胞比例和平均荧光强度；荧光定量PCR检测IRF1、CIITA以及蛋白酶体亚单位和MHC-I类分子组装相关分子伴侣的nRNA表达水平；Western blotting检测Statl蛋白磷酸化水平。 结果：雷帕霉素处理对MSCs表面的HLA-ABC表达没有影响。IFN-γ处理3天后明显增强HLA-ABC平均荧光强度,并上调蛋白酶体亚单位LMP2、LMP7、LMP10以及分子伴侣Tapasin等的mRNA表达水平。雷帕霉素对IFN-γ作用下的HLA-ABC表达也没有影响,但能提高Tapasin、 LMP7和LMP10的表达水平。MSCs正常条件下不表达HLA-DR,但在IFN-γ作用下表达明显上升。IFN-γ作用后Statl蛋白的磷酸化水平和IRF1、CIITA的mRNA表达水平也明显上升。雷帕霉素对Statl磷酸化水平和IRF1、CIITA的表达水平没有影响,然而高浓度雷帕霉素预处理能显著减弱IFN-7处理后的HLA-DR+细胞比例以及平均荧光强度。结论：雷帕霉素抑制mTOR信号途径不影啊HLA-ABC表达,但能减弱IFN-γ作用后的HLA-DR表达。
【关键词】：间充质干细胞 慢性移植物抗宿主病 雷帕霉素 免疫抑制 mTOR信号途径 免疫原性
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 致谢5-6
• 前言6-9
• 中文摘要9-13
• 英文摘要13-18
• 缩略词18-23
• 1 第一章：慢性移植物抗宿主病患者骨髓间充质干细胞生物学特性研究23-49
• 1.1 引言23-24
• 1.2 实验材料24-28
• 1.3 实验方法28-37
• 1.4 实验结果37-46
• 1.5 讨论46-49
• 2 第二章: mTOR信号途径调节骨髓间充质干细胞免疫抑制能力的作用及机制49-75
• 2.1 引言49-50
• 2.2 实验材料50-53
• 2.3 实验方法53-58
• 2.4 实验结果58-71
• 2.5 讨论71-75
• 3 第三章：mTOR信号途径调节骨髓间充质干细胞免疫原性的作用75-85
• 3.1 引言75-76
• 3.2 实验材料76
• 3.3 实验方法76-77
• 3.4 实验结果77-81
• 3.5 讨论81-85
• 4 总结85-87
• 参考文献87-97
• 综述97-110
• 参考文献104-110
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果110-

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  本文关键词：mTOR信号途径调节间充质干细胞免疫调控能力的作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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