Sprouty1在人表皮角质形成细胞中的功能研究

发布时间：2017-03-28 13:01

  本文关键词：Sprouty1在人表皮角质形成细胞中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[研究背景] Sprouty蛋白是1998年Hacohen等在果蝇基因谱的研究中,发现的Ras/MAPK信号通路特异性抑制蛋白,随后在哺乳动物中也发现其类似物,分别命名为Spry1-4。在果蝇中,该蛋白家族的分子量为63KD,而在哺乳动物中,分子量为32-34KD。Sprouty1(SPRY1)蛋白是一种富含半胱氨酸的蛋白质,最早对于Spry蛋白的功能研究认为,它是FGF介导的RTK信号通路的拮抗剂。SPRY1蛋白受一些生长因子的调节,如成纤维细胞生长因子(FGF),表皮细胞生长因子(EGF)等的调节。同时,SPRY1也对上述一些细胞因子的作用起到负性反馈调节的作用。在果蝇和其他多种生物中,SprY1蛋白在气管形成,肺部支气管形成,肾脏发生和血管新生中发挥重要的作用。 人类SPRY蛋白各个组分的表达在不同的人体组织中有所不同。SPRY1,2和4在胚胎各期及成人组织中广泛表达,而SPRY3仅表达于成人的脑和睾丸组织。各个SPRY组分之间并不能发挥相互补偿的作用。人类SPRY1基因位于4q28.1,总共包括5个外显子,整个基因包括2626bp,编码蛋白包含319个氨基酸。目前的研究发现,SPRY1基因在人体中存在两种剪接体,分别被命名为SPRY1a, SPRY1b。SPRY1蛋白具有多个结构功能域,包括C-端富含半胱氨酸的功能域,即Rafl结合功能域,一个高度保守的N-端功能域。因SPRY蛋白家族(SPRY1-4)中的各组分之间的结构相似性,因此被认为该组蛋白具有类似的RTK通路的抑制作用。 SPRY1蛋白作为多种生长因子信号通路的负性调节因子,在多种肿瘤中发现表达下调。SPRY1的表达下调的细胞表型类似于细胞因子过度激活的状态。SPRY1在多种细胞类型的肿瘤中表达下调,包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌,尤其在晚期肿瘤细胞转移过程中的上皮-间质转化相关。表观调节使SPRY1失活或杂合性缺失被认为是SPRY1在肿瘤细胞中表达下降或功能缺失的主要原因。因SPRY1可以拮抗RTK信号通路,从而发挥抗增殖、迁移,调节细胞分化和衰老的重要作用。因此,SPRY1被认为具有肿瘤抑制作用。 目前,对于影响SPRY1的表达的调节因素还不是很清楚。如多种生长因子、血清剥夺等影响。一些研究指出,在不同的细胞背景下,上述影响因素对SPRY1的调节并不尽相同。目前尚未发现SPRY1基因突变所直接导致的疾病。但是有研究显示,SPRY1基因还与肥胖、骨代谢异常等复杂性疾病状态密切相关。 皮肤是人体的第一道防线,按结构可分为表皮、真皮和皮下组织。角质形成细胞作为表皮的最主要的结构性细胞,是一种不断增殖、分化和更新的细胞,其增殖和分化过程受到多种因素的精细调节。基底层是表皮的生发层。角质形成细胞的增殖和分化状态被认为至少具有三种状态,即表皮干细胞、短暂增殖细胞和分化细胞。近年来的研究发现,多种生长因子和细胞因子可影响角质形成细胞动力学过程,如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、IL-6、TNF-α维A酸、micro-RNA等对角质形成细胞的增殖和分化产生影响。 SPRY1被认为是具有RTK信号通路负性调节作用的重要分子。在正常人体表皮中,SPRY1对人体角质形成细胞的功能的影响以及生物学行为,如角质形成细胞的分化、增殖、细胞周期、衰老、凋亡等细胞生物学功能的影响尚不清楚,因此,值得深入探讨和研究；并为今后研究该蛋白分子在一些表皮增殖相关性皮肤疾病中的作用及其机制提供重要线索。 [目的] 本研究主要观察SPRY1在正常人体表皮中的表达,以及原代培养角质形成细胞中的表达和定位；通过慢病毒感染构建过表达SPRY1的角质形成细胞和HaCaT细胞,研究SPRY1对ERK、smad等细胞信号通路,对细胞周期、增殖、分化等相关调节蛋白的表达,以及组蛋白乙酰化和甲基化修饰等的影响,以期了解SPRY1的一些重要的下游靶蛋白；观察SPRY1对细胞功能的影响；观察K14表皮定位表达SPRY1小鼠在银屑病模型、皮肤接触性变态反应、创伤修复、急性刺激性炎症反应等方面的影响。 [方法] 首先,通过对正常人体皮肤的组织免疫荧光检测,观察原位正常人表皮中SPRY1的表达定位和丰度。分离和培养原代角质形成细胞,并通过细胞免疫荧光观察其中的SPRY1的表达水平和亚细胞定位； 其次,为进一步研究SPRY1在角质形成细胞中的功能,我们通过构建过表达质粒,经DH5α菌扩增,通过工具细胞-HEK293T细胞包装病毒,再用慢病毒感染原代角质形成细胞和HaCaT细胞,建立过表达SPRY1的细胞模型,并通过RT-PCR和western blot确认慢病毒的感染效果。利用Western blot分析SPRY1过表达后其下游蛋白分子,如MAPK、PI3K-AKT、TGF-p/smad信号通路以及与表皮屏障功能、细胞分化和细胞周期等密切相关的蛋白表达水平； 此外,还检测了SPRY1对细胞组蛋白甲基化和乙酰化等表观修饰水平的影响。再次,通过SPRY1过表达慢病毒稳转细胞的建立和筛选,进一步研究过表达SPRY1的HaCaT细胞在细胞增殖、侵袭、凋亡等方面的影响； 最后,为进一步研究SPRY1在表皮中的作用,本研究通过表皮定位表达K14-SPRY1-eGFP的转基因小鼠的建立,在体(in vivo)研究过表达SPRY1对咪喹莫特诱导的银屑病模型、环钻创伤修复模型、恶唑酮诱导的变态反应性接触性皮炎模型,以及佛波脂和斑蝥素诱导的急性刺激性皮肤炎症反应模型中的影响。 [结果] 一、SPRY1在表皮和原代角质形成细胞中的表达 1.通过组织免疫荧光检测发现,在正常人表皮中SPRY1的表达仅局限于表皮的颗粒层,呈波浪状线状荧光分布,在表皮其它各层中未见明显表达。 2.在体外原代培养的角质形成细胞中,SPRY1的表达水平较低,呈胞浆分布。 二、SPRY1对角质形成细胞蛋白表达和功能的影响 1.在角质形成细胞中,SPRY1对p53和磷酸化的p53水平并未发生明显改变,但可促进P21,P27的表达,下调cyclin B1, G0S2的表达,这可能与SPRY1对细胞周期的抑制作用有关； 2. SPRY1对细胞晚期分化和表皮屏障相关组分的影响 角质形成细胞过表达SPRY1后,K1,K10,filaggrin和involucrin的表达并未发生明显改变。但AQP7、Iaminin5的表达增加,loricrin的表达可见上调,上述结果显示,过表达：SPRY1可能与角质形成细胞的晚期分化和皮肤屏障功能有关； 3. SPRY1对角质形成细胞EMT相关蛋白的影响 SPRY1对角质形成细胞vimentin. E-cadherin, N-cadherin和β-catenin的表达没有明显改变。PAI-1表达上调,integrin α6、MMP3表达减少。而PAI-1的上调和MMP3的下调可限制角质形成细胞的迁移能力； 4. SPRY1对角质形成细胞polycomb group protein (PcG)蛋白的影响 在SPRY1过表达的角质形成细胞中,Ring1B、EZH2和Bmil可见不同程度的下调,而SUZ12表达上调。生长反应蛋白-1(Egr-1)呈现轻度下调。Dickkopf1(DKK1)并未发现明显的表达改变； 5. SPRY1对细胞中组蛋白修饰(甲基化和乙酰化)相关蛋白的影响 在角质形成细胞中,SPRY1可使H3K4me2(lysine4, lysine27, lysine9)表达上调。然而,H3K79me2(lysine79, lysine36)和H3me3(H3tri-methylation)的表达并未发现明显改变。H2A, H2B, H3和H4,乙酰化的H2A, H2B, H3和H4也并未发现显著改变。HDAC1,2,3,4和6无显著改变,但是,磷酸化的HDAC4/5/7可见显著性降低； 6.SPRY1对HMG蛋白表达的影响 在SPRY1过表达的角质形成细胞模型中,HMG蛋白家族,包括HMGA1、 HMGB1、HMGB2、HMGN1和HMGN2并未发现显著改变； 7. SPRY1对smad、ERK1/2、PTEN和AKT等信号通路的影响 SPRY1对角质形成细胞的经典的信号通路的影响并不像其他肿瘤细胞系一样,SPRY1对角质形成细胞的smad、ERK1/2、PTEN和AKT的磷酸化及其整体表达水平影响并不明显； 8. SPRY1对HaCaT细胞增殖、迁移、衰老和凋亡的影响 SPRY1过表达HaCaT细胞的增殖活力较对照组降低约30%。迁移、侵袭能力较对照组HaCaT细胞约降低29.9%。在稳转SPRY1的HaCaT细胞中,其凋亡的细胞比率(9.03%)较对照组-空白质粒慢病毒感染细胞(3.8%)更高,且差异具有显著性(**P0.01)。而在过表达SPRY1的角质形成细胞中的细胞衰老率较对照组HaCaT细胞更低(8.2%/19.5%)。 S. SPRY1对小鼠炎症和创伤等皮肤模型的影响 1.SPRY1转基因小鼠,在咪喹莫特乳膏外用诱导的银屑病模型中,呈现较轻的红斑鳞屑等银屑病样皮肤反应。在皮损组织的HE染色中,可见SPRY1转基因小鼠的表皮增殖程度较野生型小鼠更轻； 2.在环钻取皮建立的创伤修复模型中,SPRY1转基因小鼠的创面修复时间较野生型小鼠延长,即呈现更缓慢的创伤修复过程； 3.在经3%恶唑酮诱导的变态反应性接触性皮肤炎症反应模型中,SPRY1转基因小鼠呈现较轻的耳廓肿胀和炎症反应,经HE和masson三色染色法比较可见小鼠耳廓厚度的显著性差异； 4.在经佛波脂和斑蝥素诱导的急性刺激性炎症反应中,转基因小鼠与野生型小鼠均可见类似的耳廓肿胀和增厚,但两组之间并未呈现出显著的差别。 [结论] 一、在正常人表皮中,SPRY1局限性表达于表皮颗粒层； 二、在正常人原代角质形成细胞中的表达水平较低,呈胞浆分布； 三、在角质形成细胞中,SPRY1促进P21,P27的表达上调,cyclin B1和GOS2下调；组蛋白的甲基化水平改变,如H3K4me2(lysine4, lysine27, lysine9)表达上调,以及磷酸化的HDAC4/5/7的显著降低等,可能与角质形成细胞的增殖活力下降和凋亡增加有关； 四、在角质形成细胞中,SPRY1可促进AQP7、Iaminin5、loricrin的表达,因此SPRY1与角质形成细胞的晚期分化和维持皮肤屏障功能有关； 五、SPRY1促进角质形成细胞PAI-1的表达,降低integrin α6、MMP3的表达,这可能与角质形成细胞的EMT活力和迁移能力下降有关； 六、在角质形成细胞中,SPRY1对HMG蛋白家族并未产生明显改变,对PcG蛋白家族组分的表达产生不同程度的影响(Ring1B、EZH2和Bmil下调,SUZ12表达上调),其具体机制和效应有待深入研究； 七、在角质形成细胞中,SPRY1并未对smad、ERK、PTEN和AKT的磷酸化及其整体水平产生明显改变,这可能是在角质形成细胞中,SPRY1并不主要依赖于上述信号通路而发挥作用； 八.SPRY1可降低HaCaT细胞增殖和侵袭能力,促进细胞凋亡；SPRY1对细胞生物学行为发挥负性调节作用； 九、在表皮局限性定位表达SPRY1的转基因小鼠中,SPRY1可减轻咪喹莫特诱导的银屑病样皮损程度,延迟创伤修复,减轻恶唑酮诱导的变态反应性接触性皮肤炎症的程度,但对佛波脂和斑蝥素诱导的急性刺激性炎症反应无明显改变。
【关键词】：sprouty1 角质形成细胞(角质细胞) 表皮 转基因小鼠 咪喹莫特
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338.3
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-13
• ABSTRACT13-18
• 本课题中使用到的主要仪器18-20
• 实验中主要试剂的配制20-24
• 英文缩写注释24-26
• 目录26-28
• 第一部分 SPROUTY1蛋白在正常表皮及角质形成细胞中的表达28-49
• 前言28-38
• 材料与方法38-41
• 结果41-43
• 讨论43-45
• 结论45-46
• 参考文献46-49
• 第二部分 SPROUTY1在正常人角质形成细胞和HACAT细胞中的功能研究49-85
• 前言49-50
• 材料与方法50-62
• 结果62-77
• 讨论77-81
• 结论81-82
• 参考文献82-85
• 第三部分 SPROUTY1转基因小鼠在体功能研究85-108
• 前言85-86
• 材料与方法86-91
• 结果91-103
• 讨论103-105
• 结论105-106
• 参考文献106-108
• 综述一108-116
• 参考文献113-116
• 综述二116-124
• 参考文献121-124
• 博士在读期间发表的论文124-126
• 博士在读期间参加的课题、学术活动与受到的奖励

【参考文献】

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1 秦超;董慧;杨健;李普;朱建;居小兵;孟小鑫;殷长军;;Sprouty2蛋白表达对肾癌细胞功能影响的实验研究[J];现代泌尿外科杂志;2012年03期

  本文关键词：Sprouty1在人表皮角质形成细胞中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：272287