拟南芥葡萄糖信号转导元件AtRGS1和AtHXK1的功能关联性研究

发布时间：2017-03-28 13:20

  本文关键词：拟南芥葡萄糖信号转导元件AtRGS1和AtHXK1的功能关联性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：葡萄糖作为细胞基础构件分子,能量代谢中枢分子,同时也是重要的信号分子,调控植物生长和发育的多个方面。拟南芥中HEXOKINASE 1(AtHXK1)和Regulator of G-protein Signaling 1(AtRGS1)是介导葡萄糖信号转导过程的两个重要葡萄糖感应器。它们对葡萄糖信号的感应和转导都不依赖于糖酵解过程。对于分别依赖AtHXK1和AtRGS1的两条葡萄糖信号转导途径的研究都已经独立开展起来,并已取得重要进展。但是,到目前为止,关于植物体内这两条信号转导途径之间是否存在某种程度的关联或者整合,国内外均无相关报道。本研究通过表型上位分析,GUS染色分析,葡萄糖应答基因的表达调控分析,蛋白质的亚细胞重定位分析,以及蛋白质间的相互作用分析等途径,发现拟南芥葡萄糖信号转导元件AtHXK1和AtRGS1之间存在复杂的关联性。主要结果如下:1.hxk1突变体和rgs1突变体都表现出对高浓度葡萄糖(6%,重量/体积)抑制幼苗生长发育过程的弱敏性,但是它们的双突变体hxk1/rgs1表现出介于两个单突变体之间的中间型弱敏性,表明AtRGS1和AtHXK1在响应高浓度葡萄糖的这个过程中,并非属于两条完全独立的信号转导途径,因为两者突变体的表型并未出现简单的叠加现象。2.在根的伸长、叶的扩展等细胞活性相关表型上,hxk1突变体和rgs1突变体存在相反的表型,而它们的双突变体hxk1/rgs1表现出介于两个单突变体之间的中间型表型,表明AtHXK1和AtRGS1在细胞活性的调控过程中,存在反馈调控的关系。在单突变体hxk1和rgs1的遗传背景下,本研究对细胞周期蛋白基因CDKA;1的表达进行了体内分析,结果再次证实了AtRGS1和AtHXK1在调控细胞活性过程中的功能关联性。3.对于高浓度的盐胁迫,hxk1突变体表现出超敏感性,rgs1突变体表现出弱敏感性,而双突变体hxk1/rgs1表现出类似于rgs1突变体的弱敏感性,表明在盐胁迫响应过程中,AtRGS1位于AtHXK1的上游,两者共同调控植物对盐胁迫的耐受力。4.At RGS1和AtHXK1以两种不同的模式共同调控葡萄糖应答基因TBL26、CA2和CAB2的表达,这两种模式与上述单突变体和双突变体在正常生长环境,以及高浓度葡萄糖或者盐胁迫环境下表现出的表型模式是一致的。5.依赖AtRGS1的葡萄糖信号转导途径的第一步——葡萄糖诱导AtRGS1发生内吞。这个过程在hxk1突变体的背景下并未发生改变,表明AtHXK1在AtRGS1信号转导途径的下游,即AtRGS1内吞后的过程中发挥功能,这与基因表达调控模型的推测是一致的。6.通过蛋白质互作数据库分析,发现AtRGS1和AtHXK1有一个共同的互作蛋白——AtRHIP1。对这个功能未知蛋白进行生物信息学分析,发现AtRHIP1是一个潜在的信号转导元件,这为分析AtRGS1和AtHXK1之间的功能关联提供了一个直接的节点。进一步通过双分子荧光互补途径,在植物细胞内对AtRGS1和AtHXK1以及AtRHIP1间的蛋白互作进行分析,确认了三者之间的蛋白相互作用。7.通过蛋白质互作数据库分析,还发现与AtRGS1存在蛋白质相互作用的另一个重要蛋白——VHA-B3。鉴于VHA-B1在依赖AtHXK1的葡萄糖信号转导途径中的潜在重要功能,以及VHA-B1与VHA-B3之间的功能关联性,通过双分子荧光互补手段,在植物细胞内也对AtRGS1和AtHXK1以及VHA-B1/3间的蛋白互作进行了分析,确认了这4个蛋白在植物细胞内的相互作用。8.通过分离鉴定获得拟南芥AtRHIP1的功能缺失突变体,转基因获得AtRHIP1的超表达体。对AtRHIP1的突变体和超表达体进行幼苗的生长发育和葡萄糖刺激响应分析,以及葡萄糖应答基因的转录调控分析,发现AtRHIP1在依赖AtRGS1和AtHXK1的葡萄糖信号转导过程中具有潜在的调控作用。综上所述,拟南芥中依赖AtHXK1的葡萄糖信号转导途径和依赖AtRGS1的葡萄糖信号转导途径组成了一个复杂的调控网络,针对具体的葡萄糖应答基因或者相关表型进行特异的调控。在这个过程中,两个不依赖糖酵解的葡萄糖感应器AtRGS1和AtHXK1相互联系,相互协调,共同对葡萄糖信号进行应答。
【关键词】：拟南芥 AtHXK1 AtRGS1 葡萄糖 信号转导
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-14
• 1 引言14-34
• 1.1 葡萄糖在植物体中的生物学重要性15-21
• 1.1.1 构件分子15-18
• 1.1.2 能量中枢分子18-19
• 1.1.3 信号分子19-21
• 1.2 酵母菌中的葡萄糖信号转导途径21-24
• 1.2.1 Hxk2/Snf1/Mig1途径22-23
• 1.2.2 Snf3/Rgt2-Rgt1途径23
• 1.2.3 cAMP/PKA途径23
• 1.2.4 酵母菌葡萄糖信号转导途径的整合23-24
• 1.3 拟南芥中的葡萄糖信号转导途径24-31
• 1.3.1 依赖AtHXK1的信号转导途径26-27
• 1.3.2 依赖AtRGS1的G蛋白信号转导途径27-29
• 1.3.3 依赖糖酵解的SnRK1/TOR信号转导途径29-31
• 1.3.4 拟南芥葡萄糖信号转导途径的整合31
• 1.4 研究的目的意义与技术路线31-34
• 1.4.1 研究目的与意义31-32
• 1.4.2 技术路线32-34
• 2 材料与方法34-54
• 2.1 实验材料34-39
• 2.1.1 植物材料34
• 2.1.2 质粒载体及菌种34
• 2.1.3 主要实验试剂和药品34-35
• 2.1.4 主要仪器35-36
• 2.1.5 引物序列36
• 2.1.6 主要试剂36-38
• 2.1.7 培养基38-39
• 2.1.8 作图和分析软件39
• 2.2 实验方法39-54
• 2.2.1 拟南芥的培养39
• 2.2.2 突变体基因型分析39-41
• 2.2.3 突变体转录缺失分析41-42
• 2.2.4 荧光定量PCR42-44
• 2.2.5 幼苗对葡萄糖的敏感性分析44
• 2.2.6 幼苗对盐胁迫的敏感性分析44-45
• 2.2.7 成株对光的敏感性分析45
• 2.2.8 蛋白质互作网络分析45
• 2.2.9 蛋白质功能聚类分析45-46
• 2.2.10 蛋白质三维结构分析46
• 2.2.11 双分子荧光互补（BiFC）分析蛋白质相互作用46-49
• 2.2.12 拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达49-51
• 2.2.13 浸花法转化拟南芥51-52
• 2.2.14 AtRGS1-YFP的细胞内吞定量分析52-54
• 3 结果与分析54-92
• 3.1 拟南芥AtHXK1缺失突变体的筛选和鉴定54-55
• 3.2 拟南芥hxk1-3/rgs1-2 双突变体的获得55-56
• 3.3 HXK1蛋白和RGS1蛋白在幼苗生长发育过程中的功能相关性56-67
• 3.3.1 高浓度葡萄糖对幼苗生长发育的抑制作用56-58
• 3.3.2 不同浓度葡萄糖对幼苗根伸长的作用58-60
• 3.3.3 幼苗叶片的生长发育60-61
• 3.3.4 葡萄糖在根端分生组织活化中的功能61-63
• 3.3.5 盐胁迫对幼苗生长发育的抑制作用63-66
• 3.3.6 幼苗对光强的敏感性分析66-67
• 3.4 AtRGS1和AtHXK1共同调控一系列葡萄糖应答基因的转录67-75
• 3.4.1 AtRGS1和AtHXK1共同调控葡萄糖对TBL26基因的诱导67-69
• 3.4.2 AtRGS1和AtHXK1共同调控TBL26基因表达的模型69-70
• 3.4.3 AtRGS1和AtHXK1共同调控葡萄糖对CA2和CAB2基因的抑制70-72
• 3.4.4 AtRGS1和AtHXK1共同调控CA2和CAB2基因表达的模型72-73
• 3.4.5 AtRGS1和AtHXK1在葡萄糖抑制DIN1基因表达中的功能73-74
• 3.4.6 AtRGS1和AtHXK1参与葡萄糖抑制DIN1基因表达的模型74-75
• 3.5 信号通路的上位分析75-77
• 3.6 生物信息学分析AtHXK1与AtRGS1间的关联性77-83
• 3.6.1 蛋白互作分析——RHIP177-80
• 3.6.2 蛋白互作分析——VHA-B1/B380-83
• 3.7 拟南芥RHIP1蛋白的亚细胞定位分析83-84
• 3.8 拟南芥RHIP1缺失突变体的筛选和鉴定84-85
• 3.9 拟南芥AtRHIP1超表达体的转化和鉴定85-86
• 3.10 拟南芥AtRHIP1缺失突变体和超表达体的表型分析86-92
• 3.10.1 拟南芥AtRHIP1缺失突变体和超表达体的生长发育表型86-88
• 3.10.2 拟南芥AtRHIP1缺失突变体中葡萄糖应答基因的调控88-91
• 3.10.3 拟南芥AtRHIP1缺失突变体背景下的AtRGS1信号途径91-92
• 4 讨论92-98
• 4.1 AtHXK1信号途径的复杂调控机制92-94
• 4.2 AtRGS1信号途径的复杂调控机制94-95
• 4.3 AtHXK1信号途径与AtRGS1信号途径之间的关联95-98
• 5 结论98-100
• 致谢100-102
• 参考文献102-116
• 攻读博士学位期间发表的学术论文116

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1 黄建萍;拟南芥葡萄糖信号转导元件AtRGS1和AtHXK1的功能关联性研究[D];东北农业大学;2015年

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本文编号：272370