水稻粒宽基因GS5的调控与分子机理研究

发布时间：2017-03-28 15:20

  本文关键词：水稻粒宽基因GS5的调控与分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻是最重要的粮食作物之一,如何提高水稻产量一直是科学研究与育种研究长期关注的重点。水稻产量由单位面积穗数、每穗实粒数和千粒重三个因素构成,千粒重由颖壳的体积和胚乳发育状况两个因素决定,对颖壳形状与体积的描述一般称为粒形,包括粒长、粒宽和粒厚,因此,粒形是重要的产量性状之一。前人通过图位克隆法分离到GS5,它是第五染色体上的一个正调控粒宽、粒重和灌浆速率的微效基因,窄粒等位基因GS5-H94与宽粒等位基因GS5-ZS97之间的差异主要是启动子区存在的18个多态性位点造成两者表达水平的高低不同。提高GS5的表达量可以增加粒宽,因为GS5影响了一系列细胞周期调控基因的表达,GS5表达量的提高可以促进颖壳细胞分裂,增加颖壳细胞数目。基于这些认识,本研究通过对以下四个问题的分析,进一步探讨GS5的表达调控和分子机理。首先,启动子区的多态性位点会造成怎样的表达模式差异?其次,启动子区的多态性位点为什么会造成这样的表达模式差异?第三,为什么GS5的表达水平与粒宽正相关?最后,GS5在水稻驯化过程中发生了怎样的故事?主要结果如下:1.GS5在绿色组织中的表达水平远高于非绿色组织,在非绿色组织中表达量最高的是发育中的幼穗。在幼穗发育过程中宽粒等位基因GS5-ZS97的表达量高于窄粒等位基因GS5-H94,而在绿色组织中GS5-H94的表达量反而更高,暗示GS5的表达受到至少两种不同因素的调控。2.GS5启动子的顺式作用元件大部分是光响应元件,两个等位基因的多态性位点主要造成光响应元件的数量不同,GS5-H94含有更多的光响应元件。研究证实GS5的表达受光照诱导,并在一天中表现出节律性变化。GS5-H94受光照诱导后表达量的改变更为剧烈,因此,可以解释GS5在绿色组织中高表达,且GS5-H94的表达量高于GS5-ZS97。3.利用一系列截短与定点诱变的启动子-GUS(β-Glucuronidase)片段分析造成幼穗中表达量差异的关键位点,发现启动子 1139 bp至 931 bp(记为B区)对GS5的差异表达具有最关键的影响。比较GS5-H94、GS5-ZS97与来自宽粒品种中花11的第三种单倍型gs5-zh11的启动子 1139bp至 604bp区段(b、c区),鉴定出gs5-h94特有的三个snps(snp_ 1109,snp_ 1032和snp_ 825),将gs5-zs97的snp_ 1109和snp_ 1032诱变为gs5-h94基因型可将其启动子强度降低到gs5-h94水平上。4.启动子b区的snp_ 1109和snp_ 1032位于一个ga(gibberellin)响应元件侧翼,c区的snp_ 825造成两个等位基因产生一个光响应元件的差异。将ga响应元件诱变缺失后,启动子强度上升,表明ga响应元件的作用是抑制表达;将光响应元件诱变后,启动子强度下降,表明光响应元件的作用是促进表达;在幼穗中,ga响应元件对启动子强度的影响更大。激素处理结果表明gs5的表达不受ga影响,但aba(abscisicacid)对gs5-h94的表达有明显的抑制作用,对gs5-zs97的影响则不明显,从而造成gs5-h94的表达量低于gs5-zs97。5.gs5是一种丝氨酸羧肽酶类蛋白,gs5-h94和gs5-zs97的蛋白质功能没有差异,表达量的提高都可以使粒宽增加。gs5是分泌性蛋白质,定位于细胞表面,与细胞膜之间存在密切联系。过量表达时有相当一部分gs5蛋白滞留在内质网中。6.酵母双杂交筛选到gs5可与细胞膜蛋白osbak1-7(拟南芥bak1(bri1-associatiedkinase1)的同源基因)的胞外lrr(leucine-richrepeat)结构域互作。如同拟南芥的报道,osbak1-7的lrr结构域也可与osmsbp1(拟南芥msbp1(membranesteroid-bindingprotein1)的同源基因)互作,这种互作会促进osbak1-7的内吞。本研究表明当细胞表面存在大量的gs5蛋白时,gs5与osbak1-7的互作会竞争性抑制后者与osmsbp1的互作,从而阻止osbak1-7的内吞。这种竞争性互作可以在一定程度上解释为什么gs5的表达水平与表型正相关。7.gs5的表达受到br(brassinosteroids)的抑制;拟南芥br信号转导途径中的一个丝氨酸羧肽酶brs1在水稻中的超表达也可使粒宽增加,且粒宽也与其表达水平正相关;加上gs5与osbak1-7的互作关系,暗示gs5很可能通过br信号转导途径调控颖壳细胞分裂和粒宽。osbak1-7超表达后植株半矮,茎秆变细,缺失突变体株高增加,茎秆变粗,可能对水稻生长具有一定的抑制作用,但粒形没有变化;osmsbp1在各个组织时期都有很高的表达,其缺失突变体成苗率极低,绝大部分在萌发后死亡,植株矮化、分蘖减少、粒形变小,表明它对水稻生长有必不可缺的作用。这两个基因在BR信号转导中的作用还需进一步研究,目前的初步结果认为它们对水稻生长的作用是相反的,GS5通过对它们互作平衡的调节实现对表型的控制。8.对527份核心种质材料和17份野生稻材料进行GS5的比较测序,从ATG上游2 kb到3’-UTR共6.4 kb的区间内鉴定出130个SNPs和27个InDels,其中70%以上的多态性位点分布在2 kb的启动子区。根据这些多态性位点可将GS5分成49个单倍型(Haplotype),归为12个单倍群(Haplogroup)。一共鉴定出10种完整形式的GS5蛋白类型,它们之间只有少数氨基酸的差异,没有发现提前终止的类型,其中GS5-P2(即GS5-H94)是最古老的蛋白质类型,GS5-P1(即GS5-ZS97)形成较晚。9.四大单倍群中,GS5-1型(即GS5-ZS97型)和GS5-2型(即GS5-H94型)主要分布在籼稻中,GS5-3型(即GS5-ZH11型)主要分布在粳稻中,GS5-4型主要分布在aus稻中。由于群体结构的存在,只能比较籼稻中GS5-1型和GS5-2型材料的粒形差异,为了剔除同一染色体上粒宽主效基因qSW5/GW5的效应影响,对其基因型进行鉴定。结果发现相同qSW5/GW5基因型的材料中GS5-1型和GS5-2型材料的粒宽没有显著差异,表明GS5的微弱效应在自然群体中被掩盖了。10.在籼稻IndI亚群中检测到GS5的Tajima’s D值显著小于0,π值非常低,且该亚群中绝大部分是GS5-1型材料,暗示形成较晚的GS5-1可能受到人工选择,但其微弱的效应似乎不太可能被人类发现和选择。分析发现Rc或Wx等驯化基因的突变并不影响GS5-1和GS5-2的基因型频率,但当qSW5/GW5位点发生突变,产生显著的大粒表型后,GS5-1的基因型频率便大大上升。由于GS5与qSW5/GW5位点之间相距仅2 Mb并存在一个连锁不平衡区域(LD block),表明GS5位点受到qSW5/GW5位点受选择的搭载效应影响,而且籼稻中qsw5/gw5的突变发生在GS5-1的背景下。
【关键词】：微效基因 差异表达 顺式作用元件 启动子强度 丝氨酸羧肽酶类蛋白 OsBAK1 OsMSBP1 竞争性互作 核心种质 qSW5/GW5 人工选择 搭载效应
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 缩略语表15-16
• 1. 前言16-39
• 1.1 调控水稻粒形与粒重的基因16-21
• 1.1.1 水稻粒形与粒重QTL的克隆16-19
• 1.1.2 油菜素内酯对粒形粒重的影响19-21
• 1.2 植物器官大小的决定21-29
• 1.2.1 植物器官的构成和形成21-22
• 1.2.2 细胞行为与器官大小22-27
• 1.2.3 有限生长——度的把握27-29
• 1.3 丝氨酸羧肽酶类蛋白的研究进展29-32
• 1.3.1 丝氨酸羧肽酶类蛋白的特点29-30
• 1.3.2 丝氨酸羧肽酶类蛋白的功能30-32
• 1.4 植物BR信号转导研究进展32-37
• 1.4.1 细胞膜表面受体BRI132-33
• 1.4.2 BRI1 的互作蛋白33-34
• 1.4.2.1 BRI1 辅助受体BAK133
• 1.4.2.2 BRI1 抑制子BKI133-34
• 1.4.2.3 BSKs与下游信号转导34
• 1.4.3 恢复bri1 突变表型的其它基因34-36
• 1.4.3.1 丝氨酸羧肽酶BRS134-36
• 1.4.3.2 内质网系统相关基因36
• 1.4.4 BRI1 与BAK1 的内吞36-37
• 1.5 工作基础与研究内容37-39
• 1.5.1 前人的研究基础37-38
• 1.5.2 本研究拟解决的问题38-39
• 2. 材料与方法39-49
• 2.1 材料来源39
• 2.2 序列分析39-40
• 2.3 载体构建与测序40-41
• 2.4 水稻遗传转化与表型鉴定41-44
• 2.4.1 农杆菌介导的水稻遗传转化41
• 2.4.2 转基因植株的阳性检测41-44
• 2.4.3 植株表型考查44
• 2.5 外源基因的瞬时表达44-45
• 2.5.1 农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达44
• 2.5.2 烟草BY-2 原生质体转化44-45
• 2.6 目标基因的表达检测45-47
• 2.6.1 RNA的抽提、反转录与Real-time PCR45
• 2.6.2 激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白45-46
• 2.6.3 总蛋白的抽提与GUS活性定量测定46
• 2.6.4 Western blot检测目标蛋白46-47
• 2.7 目标蛋白的异源表达47-48
• 2.7.1 原核表达47
• 2.7.2 毕赤酵母表达47-48
• 2.8 酵母双杂交筛选互作蛋白48-49
• 3. 结果与分析49-115
• 3.1 GS5 的表达模式分析49-52
• 3.2.1 GS5 的全生育期表达谱49-51
• 3.2.2 GS5 在颖壳和胚乳发育过程中的表达模式51-52
• 3.2.3 GS5 在叶片中的表达模式52
• 3.2 GS5 表达的调控因素52-63
• 3.2.1 启动子顺式作用元件分析52-55
• 3.2.2 光照对GS5 表达的影响55-58
• 3.2.3 造成幼穗中GS5 差异表达的关键位点58-61
• 3.2.4 激素对GS5 表达的影响61-63
• 3.3 GS5 蛋白的性质分析63-73
• 3.3.1 GS5 蛋白氨基酸序列的分析63-67
• 3.3.2 GS5 蛋白的异源表达67-68
• 3.3.2.1 GS5 蛋白的原核表达67
• 3.3.2.2 GS5 蛋白的毕赤酵母表达67-68
• 3.3.3 水稻中超表达GS5-FLAG68-71
• 3.3.3.1 GS5-FLAG蛋白的纯化与分析68
• 3.3.3.2 GS5-H94 蛋白和GS5-ZS97 蛋白的功能比较68-69
• 3.3.3.3 GS5 发挥功能可能不需要活性的发挥69
• 3.3.3.4 GS5 特异控制粒宽69-71
• 3.3.4 GS5 蛋白的亚细胞定位71-73
• 3.3.4.1 超表达植株的GS5-GFP定位71
• 3.3.4.2 烟草叶片瞬时表达GS5-GFP71-73
• 3.3.4.3 BY-2 原生质体瞬时表达GS5-GFP73
• 3.4 GS5 蛋白的作用途径初探73-96
• 3.4.1 利用GS5-BD融合载体筛选酵母双杂交文库73-80
• 3.4.1.1 GS5-BD融合载体的自激活活性检测与酵母毒性检测73-74
• 3.4.1.2 GS5 分子内的点对点实验74-75
• 3.4.1.3 GAL4 AD融合文库筛选75
• 3.4.1.4 BKA筛库结果分析75
• 3.4.1.5 互作候选基因的点对点验证75-77
• 3.4.1.6 互作候选基因的表达谱分析77-80
• 3.4.1.7 互作候选基因的亚细胞定位预测80
• 3.4.2 GS5 与OsBAK1 的互作分析80-85
• 3.4.2.1 OsBAK1 序列分析与点对点验证80-82
• 3.4.2.2 GS5 和OsMSBP1 对OsBAK1 亚细胞定位的影响82-85
• 3.4.3 OsBAK1 和OsMSBP1 的功能初探85-89
• 3.4.3.1 OsBAK1 和Os MSBP1 的表达谱分析85
• 3.4.3.2 OsBAK1 的遗传材料表型考查85-88
• 3.4.3.3 OsMSBP1 突变体表型考查88-89
• 3.4.4 水稻中超表达AtBRS189-92
• 3.4.4.1 AtBRS1 超表达材料的表型考查89-90
• 3.4.4.2 超表达AtBRS1 和GS5 对BR合成与信号转导的影响90
• 3.4.4.3 超表达AtBRS1 和GS5 对内质网胁迫相关基因的影响90-92
• 3.4.5 GS5 与OsBRI1 的互作分析92-96
• 3.4.5.1 LRR区突变的OsBRI1 蛋白的构建92
• 3.4.5.2 GS5 与OsBRI1 的点对点实验92-93
• 3.4.5.3 GS5 对OsBRI1 亚细胞定位的影响93-96
• 3.5 GS5 的比较测序与进化96-115
• 3.5.1 本室水稻核心种质材料概况96-99
• 3.5.1.1 核心种质材料的原产地96
• 3.5.1.2 核心种质材料的群体结构96
• 3.5.1.3 核心种质材料的粒形多样性96-99
• 3.5.2 GS5 的核酸多态性与中性检测99-105
• 3.5.3 GS5 的单倍型分析105-108
• 3.5.4 qSW5/GW5 的单倍型鉴定108-109
• 3.5.5 GS5 与qSW5/GW5 的关系109-112
• 3.5.6 GS5 的进化模式112-114
• 3.5.7 qsw5/gw5 突变的分布114-115
• 4. 讨论115-125
• 4.1 GS5 的表达调控115-116
• 4.2 GS5 是微效基因116-117
• 4.3 GS5 的作用机理117-120
• 4.4 GS5 的进化模式120-121
• 4.5 粒长和粒宽的调控121-123
• 4.6 后续研究的着手点123-125
• 参考文献125-136
• 附录136-176
• 附录Ⅰ：部分实验操作步骤136-153
• Protocol 1：感受态细胞的制备136-137
• Protocol 2：测序反应与产物纯化137
• Protocol 3：农杆菌介导的水稻遗传转化（粳稻）137-142
• Protocol 4：小样DNA的抽提142
• Protocol 5：烟草BY-2 原生质体转化142-144
• Protocol 6：CsCl密度梯度离心纯化质粒DNA144-146
• Protocol 7：植物总RNA的抽提与反转录146
• Protocol 8：Real-time PCR与结果的分析146-147
• Protocol 9：Bradford法测定蛋白质浓度与GUS活性的定量测定147-149
• Protocol 10：SDS-PAGE与Western blot149-150
• Protocol 11：酵母双杂交相关实验150-153
• 附录Ⅱ：533 份水稻核心种质清单153-169
• 附录Ⅲ：17 份野生稻材料清单169-170
• 附录Ⅳ：研究中涉及的引物清单170-175
• 附录Ⅴ：作者简介175-176
• 致谢176-178

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李一博;水稻粒形、粒重基因GS5及垩白基因Chalk5的克隆与功能研究[D];华中农业大学;2011年

  本文关键词：水稻粒宽基因GS5的调控与分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：272538