硫矿硫化叶菌Hsp14.1和Hsp20.1的结构和分子伴侣活性调控机制研究

发布时间：2017-03-28 20:21

  本文关键词：硫矿硫化叶菌Hsp14.1和Hsp20.1的结构和分子伴侣活性调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小热激蛋白是分子伴侣中的超级家族,几乎存在于所有生物体和多个细胞组织中。在压力条件下,小热激蛋白能够结合并抑制变性客户蛋白的聚集和沉淀而发挥重要的作用。生物体在缺失小热激蛋白的分子伴侣功能后会对环境压力如热,低氧,酸或碱等变得敏感。人源中的小热激蛋白的功能缺失会导致自身免疫性疾病,神经变性紊乱,白内障等多重疾病的发生。但是关于小热激蛋白在压力条件下与客户蛋白的相互作用机制以及使细胞耐受压力的机制,我们知之甚少。越来越多的研究表明大约由25个氨基酸组成的N末端对小热激蛋白与底物的结合非常关键,但是具体的底物的结合机制以及相关的分子伴侣活性调节机制仍然没有研究透彻。关于N末端怎么能够适应大小,形状,表面疏水和带电性等各异的不同种类的变性客户蛋白一直难以解释清楚。由于变性的客户蛋白是多相的且没有确定的三维结构,很难直接研究小热激蛋白与客户蛋白的复合物结构,因此,到目前为止,也还没有获得过N末端清晰可见且处于活性状态的小热激蛋白的三维结构。本论文以硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfatataricus P2)来源的小热激蛋白HSP14.1为研究对象,以结构研究为基础,并结合体内体外功能实验,验证分析N末端的构象变化以适配非活性客户蛋白的分子机制。我们解析了Hsp14.1的野生型以及突变体A102D和Del-C4的三维结构,三个结构都有完整而清晰的N末端,但是N末端的构象却有很大的差异。野生型的N末端呈现为直的螺旋,但是突变体的N末端螺旋却发生了严重的扭结与破坏。扭结与破坏的螺旋形成了一个疏水口袋似乎能够识别未折叠的客户蛋白。随后,功能上的突变研究表明对这个疏水口袋的关键氨基酸突变会影响宿主菌在热压力下的存活率。通过结构对比分析,发现直的N末端螺旋不能形成疏水口袋。野生型和突变体的N末端的结构差异表明N末端存在一个分子开关能够使Hsp14.1从静息状态转变到活性状态。同样的机制可能应用到同家族的其它小热激蛋白中。基于结构数据,普遍认为依靠β6链存在与否的二聚化模式可以区分后生动物和非后生动物的小热激蛋白。本研究中解析的硫矿硫化叶菌Hsp20.1 ACD二聚体结构却展示了一个完全不同的二聚体界面。我们发现,虽然没有β6链,Hsp20.1 ACD二聚体既没有像后生动物的小热激蛋白那样依靠β7链形成二聚体界面,也没有解聚成单体。这与所有已报道的小热激蛋白的结构不同。Hsp20.1 ACD二聚体结构揭示了一个可变的,高度极性的二聚体界面,有利于快速地进行亚基交换和底物识别。有趣的是,我们发现Hsp20.1的C末端突变体尽管不能形成多聚体结构,但仍然具有分子伴侣活性。进一步的突变研究表明N末端对Hsp20.1多聚体和二聚体的底物结合很关键。另外,有大量研究表明小热激蛋白在热压力下能够通过抑制聚集来保护细胞,但是关于酸压力下小热激蛋白对细胞的保护功能却不见报道。在本研究中,我们发现Hsp20.1和Hsp14.1多聚体在低p H条件下能够发生解离,甚至呈现二聚体和单体,仍然有分子伴侣活性。而它们在50°C条件下却没有显著的四级结构改变,但也有抑制底物聚集的能力。这些结果表明小热激蛋白在不同的压力条件下可能有不同的发挥功能的模式。
【关键词】：小热激蛋白 分子开关 二聚体界面 酸压力 温度压力
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 缩略符号13-14
• 第一章 绪论14-44
• 1.1 小热激蛋白维持细胞稳态的重要性及与疾病的关联14-21
• 1.1.1 小热激蛋白与细胞内稳态14-17
• 1.1.2 小热激蛋白与疾病的关联17-21
• 1.2 小热激蛋白的结构特征21-27
• 1.2.1 小热激蛋白的结构组成21-22
• 1.2.2 小热激蛋白的单体和二聚体结构22-23
• 1.2.3 小热激蛋白的多聚体结构23-25
• 1.2.4 小热激蛋白结构的稳定性25
• 1.2.5 小热激蛋白结构的动态平衡25-27
• 1.3 小热激蛋白的分子伴侣功能27-35
• 1.3.1 热激活效应28-29
• 1.3.2 酸激活效应29-30
• 1.3.3 氧化激活效应30-32
• 1.3.4 结构和功能的关系32
• 1.3.5 底物保护机制32-35
• 1.4 小热激蛋白与底物复合物的研究进展35-38
• 1.4.1 底物结合区域35-36
• 1.4.2 复合物结构36
• 1.4.3 小热激蛋白与底物结合的动态平衡36-38
• 1.5 古菌中的小热激蛋白38-43
• 1.5.1 古菌中小热激蛋白的结构特点38-42
• 1.5.2 古菌中小热激蛋白的功能特点42-43
• 1.5.3 小热激蛋白SsHsp14.1 和SsHsp20.1 简介43
• 1.6 本论文研究的目的和意义43-44
• 第二章 材料和方法44-69
• 2.1 实验材料44-52
• 2.1.1 基因44
• 2.1.2 大肠杆菌菌株44-45
• 2.1.3 质粒45
• 2.1.4 常用试剂和耗材45-47
• 2.1.5 结晶筛选与优化试剂盒47
• 2.1.6 实验仪器47-49
• 2.1.7 溶液配制49-52
• 2.2 实验方法52-69
• 2.2.1 基因克隆52-56
• 2.2.2 蛋白表达与纯化56-61
• 2.2.3 蛋白质晶体生长与优化61-63
• 2.2.4 X射线晶体结构测定63-65
• 2.2.5 序列比对65
• 2.2.6 分子筛（SEC）分析sHsps的寡聚体状态65-66
• 2.2.7 圆二色谱（CD）实验66-67
• 2.2.8 sHsps的体外分子伴侣活性实验67
• 2.2.9 sHsps抑制底物沉淀的SDS-PAGE实验67-68
• 2.2.10 菌落形成实验68-69
• 第三章 SsHsp14.1 的结构生物学研究69-96
• 3.1 SsHsp14.1 的生物信息学分析69-70
• 3.2 SsHsp14.1 的表达纯化70-79
• 3.2.1 HISGST-SsHsp14.1 的表达与纯化71-73
• 3.2.2 HISGST-SsHsp14.1 的结晶条件筛选及优化73-74
• 3.2.3 HIS-SsHsp14.1 的表达纯化与结晶74
• 3.2.4 CBD-SsHsp14.1 的表达纯化74-75
• 3.2.5 SsHsp14.1-C-HIS的表达纯化75-76
• 3.2.6 无亲和标签的SsHsp14.1 的表达纯化76-79
• 3.3 SsHsp14.1 的结晶与优化79-86
• 3.3.1 SsHsp14.1 的结晶条件初筛79-80
• 3.3.2 SsHsp14.1 的结晶条件优化80-84
• 3.3.3 SsHsp14.1 的结晶条件复筛与优化84-86
• 3.4 SsHsp14.1 的结构分析86-94
• 3.4.1 SsHsp14.1 的结构解析86-88
• 3.4.2 N端可见的SsHsp14.1 的三维结构88-92
• 3.4.3 缺失突变验证N端对结合底物的重要性92-94
• 3.5 本章小结94-96
• 第四章 SsHsp14.1 的自组装复合物结构生物学研究96-116
• 4.1 复合物的研究方法分析96
• 4.2 突变体设计及表达纯化96-100
• 4.2.1 IXI基序缺失突变体的表达纯化96-98
• 4.2.2 β4-β8 疏水沟区域的突变体的表达纯化98-100
• 4.3 突变体的结晶及优化100-104
• 4.3.1 IXI基序缺失突变体的结晶100-101
• 4.3.2 β4-β8 疏水沟区域的突变体的结晶101-104
• 4.4 突变体的结构分析104-114
• 4.4.1 Del-C4 的三维结构104-106
• 4.4.2 A102D的三维结构106-108
• 4.4.3 Del-C4 和A102D自组装复合物的形成的作用方式分析108-112
• 4.4.4 Del-C4 和A102D及WT的结构对比分析112-113
• 4.4.5 关键氨基酸介导的N末端的构象转换113-114
• 4.5 本章小结114-116
• 第五章 SsHsp14.1 结构基础上的体外的底物保护机制研究116-123
• 5.1 突变体设计116
• 5.2 热变性条件下的分子伴侣活性116-118
• 5.3 化学变性条件下的分子伴侣活性118-122
• 5.4 本章小结122-123
• 第六章 SsHsp14.1 结构基础上的体内的底物保护机制研究123-139
• 6.1 N末端的疏水氨基酸基序123
• 6.2 N末端的氨基酸突变策略123-124
• 6.3 体内实验验证参与分子伴侣活性的N末端的关键氨基酸124-130
• 6.3.1 负突变验证124-127
• 6.3.2 正突变验证127-128
• 6.3.3 正负突变的菌体存活率分析128-130
• 6.4 基于结构和功能分析N末端调节的底物保护机制130-137
• 6.4.1 N末端调控多聚体结构的组装130-131
• 6.4.2 N末端调节分子伴侣活性131-135
• 6.4.3 底物保护机制分析135-137
• 6.5 本章小结137-139
• 第七章 SsHsp20.1 的结构和功能特性研究139-163
• 7.1 SsHsp20.1 的生物信息学分析139-141
• 7.2 SsHsp20.1 的表达纯化141-147
• 7.2.1 SsHsp20.1 WT的表达纯化141-144
• 7.2.2 SsHsp20.1 截断体的表达纯化144-147
• 7.3 SsHsp20.1 的结晶147-149
• 7.3.1 SsHsp20.1 WT的结晶147-148
• 7.3.2 SsHsp20.1 截断体的结晶148-149
• 7.4 SsHsp20.1 的ACD结构解析149-155
• 7.4.1 SsHsp20.1 ACD的三维结构149-151
• 7.4.2 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 的三维结构比对分析151-152
• 7.4.3 β6 缺失的多极性的SsHsp20.1 的二聚体形成界面152-155
• 7.5 SsHsp20.1 的C末端参与多聚体结构的组装155-159
• 7.6 SsHsp20.1 的N末端对底物的结合至关重要159-160
• 7.7 本章小结160-163
• 第八章 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 在不同压力条件下的结构和功能差异研究163-185
• 8.1 酸诱导的四级结构变化164-167
• 8.1.1 SsHsp20.1 在不同pH条件下的四级结构164-166
• 8.1.2 SsHsp14.1 在不同pH条件下的四级结构166-167
• 8.2 酸诱导的二级结构变化167-170
• 8.2.1 SsHsp20.1 在不同pH条件下的二级结构167-169
• 8.2.2 SsHsp14.1 在不同pH条件下的二级结构169-170
• 8.3 酸压力条件下的分子伴侣活性研究170-177
• 8.3.1 SsHsp20.1 在pH 4.0 条件下的分子伴侣活性170-172
• 8.3.2 SsHsp14.1 在pH 4.0 条件下的分子伴侣活性172-174
• 8.3.3 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 从pH 2.0 回复到pH 7.0 条件下的分子伴侣活性174-177
• 8.4 温度压力条件下的结构变化177-180
• 8.4.1 温度诱导的SsHsp20.1 和SsHsp14.1 四级结构变化177-179
• 8.4.2 温度诱导的SsHsp20.1 和SsHsp14.1 二级结构变化179-180
• 8.5 SsHsp20.1 和SsHsp14.1 在 50 °C下的分子伴侣活性180-181
• 8.6 酸和温度压力条件下的结构和分子伴侣活性的差异性分析181-183
• 8.6.1 不同的压力感应强度和方式181-182
• 8.6.2 不同的底物结合模式182-183
• 8.7 本章小结183-185
• 结论185-188
• 参考文献188-201
• 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果201-202
• 致谢202-204
• 附件204

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