新型猪3型腺病毒（PAdV-3）表达系统及衣壳表面展示系统的研究

发布时间：2020-06-26 05:25

【摘要】：猪腺病毒3型(Porcine adenovirus type 3,PAd V-3)是猪腺病毒的优势血清型,几乎没有致病性,广泛分布于世界各地的猪群中。虽然该腺病毒仅感染猪,不感染人类和其他动物,但是该病毒可以转导多种人和动物的细胞。以该病毒为基础的载体增殖滴度高,可以稳定地携带外源基因并实现外源基因在转导细胞中高效表达。此外,该病毒与人腺病毒之间没有交叉免疫反应,因此,猪腺病毒3型载体既可以作为猪用疫苗的投递系统,又具有作为人用基因治疗和疫苗投递系统的潜力。尽管PAd V-3具有很多优点,但是在其应用之前,特别是在人类临床应用方面,仍需进行大量的评估。然而,猪腺病毒载体的研究远落后于人腺病毒载体。一方面,虽然目前已经成功构建了猪腺病毒载体系统,但是利用该系统构建猪腺病毒载体是一个复杂,耗时的过程,限制了猪腺病毒载体的研究与应用;另一方面,为什么研究衣壳?猪腺病毒载体衣壳表面展示的研究一直处于空白。为了突破这些瓶颈,本研究首先构建了简便、高效、廉价的猪腺病毒表达平台,并在研究猪腺病毒3型次要结构蛋白IX功能的基础之上,构建了猪腺病毒表面展示平台,这些研究结果为后续猪腺病毒载体的改造和应用奠定基础。1.一种高效的PAd V-3表达系统的构建作为一种人腺病毒的候选替代载体,猪腺病毒载体已经被应用于人和动物的疫苗研究。然而,依赖重组酶A(Rec A)的重组技术的猪腺病毒载体的构建过程复杂,耗时费力。为了克服这一缺点,本研究构建了一个基于SLi CE克隆技术和致死基因Ccd B筛选技术的PAd V-3表达系统。研究表明,利用该系统可以在3 days内通过单次PCR、单次SLi CE反应、单次常规转化构建猪腺病毒载体质粒,其克隆效率高达620±49.56 CFU/ng,克隆精确度为大于99%,随机挑选的阳性克隆可以成功进行病毒拯救,并且重组病毒能有效的在宿主细胞中表达外源基因。这些结果表明,我们构建了一个简便、高效、廉价的猪腺病毒表达系统。2.p IX的C端融合红色荧光蛋白mcherry影响PAd V-3的复制p IX是腺病毒载体理想的表面展示平台。为了评估p IX作为PAd V-3表面展示平台的可能性,本研究将荧光蛋白mcherry融合到PAd V-3的p IX的C末端,构建了重组猪腺病毒载体,并对载体特性进行了评估。结果表明,p IX的C端融合mcherry的r PAd V-3虽然可以被拯救,但是其在宿主细胞中的复制能力严重下降。研究还发现,p IX的C端融合mcherry以后,该融合蛋白不能有效定位于细胞核中,这也许是该重组病毒复制能力下降的原因。这些结果表明,通过在PAd V-3 p IX C末端融合进行表面展示外源多肽会影响病毒的复制。这也提示,p IX在PAd V-3的复制过程中发挥重要作用。3.p IX是PAd V-3的复制非必需基因p IX是一个多功能蛋白,在病毒生活史的多个环节中均发挥重要作用。本研究通过对PAd V-3的p IX进行缺失突变,构建重组病毒,进行病毒拯救试验,并对拯救获得的重组病毒的生物学特性进行详细研究。研究结果表明,p IX缺失的重组PAd V-3可以成功的被拯救,但是p IX缺失后,该病毒的热稳定性、复制能力以及其形成噬斑能力均显著下降。这些结果提示:p IX是PAd V-3衣壳蛋白的成分,该蛋白对病毒的包装和衣壳的形成是非必需的,但是其在病毒衣壳稳定的维持、病毒复制以及病毒致细胞病变中均发挥重要作用。4.PAd V-3的p IX C端结构域的缺失影响病毒的复制为了进一步解析PAd V-3的p IX的功能,本研究通过氨基酸序列比对和结构分析,将PAd V-3的p IX蛋白分为N端保守区,Coiled-Coil结构域和C端结构域,其中其C端结构域是PAd V-3的特有的。通过对PAd V-3 C端结构域进行缺失突变,构建重组病毒,进行病毒拯救试验,并对拯救获得的病毒的生物学特性进行测定。研究结果表明,虽然缺失C端结构域不影响该病毒的热稳定性,但是该病毒的复制能力和致细胞病变能力均远低于野生型PAd V-3,而与完全缺失p IX的病毒相似。这些研究结果表明,虽然PAd V-3的p IX C端结构域与病毒衣壳的稳定性无关,但是该区域是p IX影响PAd V-3高效复制的关键功能域。5.p IX嵌合法实现PAd V-3表面展示的研究p IX在腺病毒衣壳中有240拷贝,通过其C末端融合,可以将多种不同配体同时展示在病毒衣壳表面上。考虑到p IX对PAd V-3复制的重要性,本研究采用野生型p IX和融合p IX嵌合的策略,以期实现PAd V-3的衣壳表面展示。研究结果发现,嵌合病毒具有和野生型病毒相似的复制能力和热稳定性,而且p IX-mcherry融合蛋白可以展示到病毒表面上。这一结果表明,采用p IX嵌合法可以成功实现PAd V-3的衣壳表面展示。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：

图 1-1、 腺病毒粒子的组成与结构Fig 1-1. Overall AdV structure and components.(a) 正二十面体衣壳结构及组成。左边为一个低分辨率的冷冻电镜建模图。右面为正二十面体一个三角形面的模式图。(b) 非衣壳蛋白组成。(a) Icosahedral shell organization according to current structural knowledge. (b) Non-icosahedralcomponents.1.2 腺病毒载体病毒载体是最理想基因投递系统。据统计，以腺病毒载体为投递系统的临床试验占所有的基因治疗的临床试验的 23.5%。与其他基因转移系统相比，腺病毒载体具有以下优势：（1）腺病毒载体既能转导分裂细胞，又能转导静息细胞。（2）腺病毒不整合到宿主细胞基因组，插入变异风险低（Stephen et al. 2010）。（3）腺病毒载体的插入容量大，第三代腺病毒载体的插入容量可以达到 36kb。（4）腺病毒载体的滴度高，易于大量制备目前，符合 GMP 的腺病毒载体的培养和纯化工艺已经被开发出来。在人类的 57 个血清型中，以 C 群的人腺病毒 5 型（HAdV-5）的研究最为清楚，以

第一章 动物腺病毒载体研究进展 Emini.2004）。然而，研究表明,80%的成年人群自然感染过腺病毒，机体存在针对腺病毒的体液免疫和细胞免疫（Garnett et al.2002）。先前存在的免疫反应不但影响基因投递的效果（Kuriyama et al. 1998），而且针对病毒载体和转基因产物的免疫反应会导致多种副作用。2003 年，在应用腺病毒载体进行基因治疗时，高滴度腺病毒载体引起了全身炎症反应综合征，造成了病人死亡，这一事件给腺病毒载体的应用敲响了警钟（Raper et al2003）。此外，病毒载体转导肝脏和脾脏的免疫细胞导致的免疫反应也严重影响腺病毒载体的治疗效果。改变的腺病毒的肝脏嗜性和腺病毒的中和表位是降低腺病毒载体的免疫反应的有效途径。腺病毒衣壳蛋白结构及其与受体的相互作用的多样性使得解决先前存在的腺病毒的免疫反应成为可能。目前，已经多种稀有血清型的人类腺病毒和动物腺病毒载体被开发出来，并逐步应用于疫苗开发和基因治疗的研究。1.3 腺病毒免疫研究进展1.3.1 腺病毒介导的免疫反应

【相似文献】

相关博士学位论文 前1条

1 张鹏;新型猪3型腺病毒（PAdV-3）表达系统及衣壳表面展示系统的研究[D];西北农林科技大学;2015年

本文编号：2729885