miR-1188在小鼠胚胎发育和肝癌细胞中的功能研究

发布时间：2020-07-07 10:28

【摘要】：mi R-1188位于小鼠12号染色体(12q F1)Dlk1-Dio3印记簇内,其宿主基因Meg8是一个母本表达的长非编码RNA。在Dlk1-Dio3印记区内存在着哺乳动物中最大的mi RNAs簇,其区域内的元件Meg3(Gtl2)、anti-sense Rtl1(as-Rtl1)、Meg8(Rian)内含子中以及基因间都有mi RNAs的存在。其中,小鼠内mi RNAs总数量52个,人为54个,它们中的大多数mi RNAs是同源的,且只有mi R-1247为反向转录。已有研究表明,Dlk1-Dio3区域内的元件以及mi RNAs对胚胎发育和癌症发生中都有重要的作用。其中,Meg3的缺失会阻止胚胎发育以及肝癌的发生;而分别位于位于mi R-1188上下游的mi R-127和mi R-370,均影响胚胎发育并诱发肝癌的发生,这暗示着mi R-1188的表达变化可能与簇内其它基因具有相同的生物学功能。故本文以小鼠Dlk1-Dio3区域内的mi R-1188为研究对象,分析了胚胎发育过程中的动态变化,并结合发育相关靶基因对mi R-1188在胚胎发育过程中的功能进行分析;同时以mi R-1188特异性低表达的肝癌细胞Hepa1-6为研究对象,结合肿瘤相关靶基因解析mi R-1188在肝癌细胞中的作用。本研究首先分析了mi R-1188在胚胎发育的各个时期以及不同鼠源癌症细胞系内的表达情况。定量结果表明mi R-1188成熟体广泛表达于胚胎发育的各个时期,在早期胚胎发育的4-细胞内表达较高,至发育中后期E12.5到E18.5天表达逐渐升高;而且在E15.5天的肝脏中特异性高表达,脑、肺脏和心脏次之,肾脏中表达相对较低,原位杂交结果表明mi R-1188在E15.5的表达模式与宿主基因Meg8的表达模式是相一致的;伴随肝脏发育功能的转移,其表达水平逐渐下调,即mi R-1188在胚肝造血期高表达,其中E15.5天达到最高,出生后表达降低;而后对鼠源的各种癌症细胞系内mi R-1188表达分析发现,在肝癌细胞Hepa1-6内的表达量相对最低,同时证实mi R-1188在正常成体肝脏组织和Hepa1-6细胞内差异表达,该结果意味着mi R-1188与癌症发生存在相关性。为一进步了解mi R-1188对胚胎发育的影响,通过尾静脉注射过表达mi R-1188的慢病毒载体至妊娠初期孕鼠,过表达mi R-1188后引起E15.5天胚胎体重减轻,相应胎盘重量增加;定量结果表明mi R-1188成熟体在全胚、胎盘以及羊膜上均有过量富集;其中,在E15.5天肺脏和肝脏内都呈现出高表达;但HE及原位杂交数据表明过表达mi R-1188后并未引起胚胎内各主要脏器细胞的异常;由于mi RNAs是通过调控靶基因而发挥功能,本研究通过生物信息学预测,并结合双荧光素酶报告基因和Western blot,证实胚胎发育相关基因Smad3为mi R-1188的靶基因之一;相关性分析证实,二者在小鼠胚胎发育各个时期的表达存在负相关,即Smad3在小鼠胚胎早期发育中的2-细胞期相对4-细胞高表达,发育中期E15.5天低表达,以及E15.5天内肝脏的特异性低表达等;而且,在过表达mi R-1188的胚胎内检测其Smad3的表达,发现Smad3在胎盘、心脏、肝脏和肾脏中同样存在负相关,该结果表明mi R-1188通过调控发育功能基因Smad3的表达,参与胚胎发育。最后,为确定mi R-1188在癌症中的重要功能,本研究通过改变内源性mi R-1188的表达水平,发现mi R-1188可抑制肝癌细胞Hepa1-6的增殖、侵袭和迁移,引起细胞铺展面积的减小,同时促进细胞凋亡和Caspase-3的激活;而且,mi R-1188直接靶向肿瘤相关基因Bcl-2和Sp1,且在转录后调控二者的表达,同时发现mi R-1188与Bcl-2和Sp1在正常肝脏组织和肝癌细胞Hepa1-6内表达水平存在负相关;过表达mi R-1188后上调相关凋亡基因Bax和p53的表达,以及下调Bcl-XL的表达;进一步分析证明,Hepa1-6细胞内分别共转染mi R-1188模拟物与靶基因Bcl-2和Sp1的干扰片段,确定mi R-1188是通过调控Bcl-2和Sp1的表达参与Hepa1-6细胞的生物学行为;并且体内成瘤实验充分说明了mi R-1188具有肿瘤抑制子的功能,并揭示了mi R-1188参与调控肝癌细胞行为的各种途径。综上所述,mi R-1188是一个广泛表达于胚胎及各种癌症细胞系的mi RNA。mi R-1188引起胚胎发育重量的减少和胎盘重量的增加,以及体内外抑制肝癌细胞的生长等生物学效应,并通过调控不同靶基因的表达参与生物体的各项活动。深入研究mi R-1188的功能对进一步研究小鼠Dlk1-Dio3区域内mi RNAs的调控机制具有重要意义。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7;Q78

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本文编号：2745009