小金海棠MxNRAMP1蛋白铁转运机制初探

发布时间：2020-07-19 14:59

【摘要】：缺铁黄叶病对果树的产量、品质、树势及经济效益均造成极大的损失,因此寻求矫治缺铁失绿症的各种途径和方法变得越来越重要。小金海棠是铁高效基因型,可以用作一个砧木帮助苹果在铁缺乏的条件下正常生长和发育。小金海棠在应答缺铁胁迫时会加强根部铁吸收,然而其铁高效机理还不是很清楚。本文以小金海棠(Malus xiaojinensis)为试验材料,克隆了小金海棠铁转运蛋白基因MxNRAMP1,并通过其基因特征以及功能分析,来探究MxNRAMP1基因参与小金海棠铁吸收和转运的方式与作用。主要结果如下： 1、MxNRAMP1基因全长1656bp,共编码551个氨基酸,预测其编码的蛋白质分子量为59.80kD,等电点为8.05。多序列比对表明,MxNrampl与其他物种的Nramp均有不同程度的同源性。MxNRAMP1蛋白分析表明其包含了10个跨膜结构域,具有叶绿体转运肽,可能定位于叶绿体,无分泌通路信号肽。 2、检测了不同铁处理的MxNRAMP1转录表达谱,MxNRAMP1在根和叶中的表达均受缺铁诱导,而且在根中的表达量明显高于叶片。与对照(正常铁处理)相比,在缺铁处理3d,6d,9d的根中,MxNRAMP1转录提高4倍以上；相对于根,新叶和老叶中的MxNRAMP1的诱导上调表达比较迟,在缺铁9d才显示了较为明显的上调。缺铁处理下施加生长素抑制剂NPA会抑制缺铁胁迫对MxNRAMP1的诱导。 3、稳定转基因烟草植株表现出比野生型和转空载植株更为耐缺铁,各种铁处理下,转基因株系的新叶与根中Fe、Mn浓度高于转空载株系与野生型,Zn浓度没有明显差异。结果表明：MxNRAMPl过表达促进转基因烟草根对铁的吸收及铁在根和叶中的积累,从而导致对铁胁迫的抗性增强；过表达转基因烟草中的蛋白表达分析表明,根中MxNRAMP1蛋白的表达受到缺铁诱导。 4、洋葱表皮亚细胞定位分析表明MxNRAMP1蛋白主要定位在细胞膜上,利用玉米原生质瞬时表达体系和转基因烟草免疫电镜定位技术进一步证明,MxNRAMP1主要存在于细胞质膜与膜泡上,显示MxNRAMP1蛋白为明显的功能性基因蛋白。有趣的是,缺铁胁迫可诱导MxNRAMP1蛋白以膜泡内吞方式,转运铁离子到达特定的细胞器(溶酶体、叶绿体)。上述结果表明,在小金海棠中,MxNRAMP1不仅在铁吸收和转运中起着重要作用,而且还可以通过MxNRAMP1内吞使植物产生缺铁适应反应。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【图文】：

铁胁迫,缺铁胁迫,信号肽序列,预测分析

MK ..二: ‘ ? .■?:_?? ■■■-图3-4M}(;NRAMPl保守结构域分析Fig.3-4 Analysis conserved domain of MxNRAMPISanalP-4 1 predsction (euk networks}' MRAMF1I ‘”"? ' ‘ ‘ C-score -?10 ■ Sscore .Y-scoreo.a - ■0.6 - I ■I 。.4 . j |j I ; . ?。之 I ‘ !jH,lpA k .：■0,0 .二一 rt- —■ *Ji '殊 ji-ar?? * i 二 -, I > t t... I..,.,.. - —.t—- 0 100 200 300 400 500 $00Position图3-5 MxNRAMPI编码蛋白的信号肽序列预测分析Figure 3-5 The prediction of signal peptide of MxNRAMPI32 MxNRAMPI基因的表达分析3.2.1缺铁处理MxNRAMPI基因的表达为了进一步研究MxNRAMPI基因与铁胁迫之间的关系，检测了不同铁处理的MxNRAMPI转录表达谱。结果表明：MxNRAMPI在根中的农达量明显高于叶片，而且根和叶中的表达均受缺铁胁迫诱导（图3-6)。与对照相比，在缺铁处理3d, 6d, 9d的根中，MxNRAMPI转录提高4倍以上；相对于根，新叶和老叶中的MxMMMW的诱导上调表达比较迟，在缺铁9 d才显示了较为明显的上调(图3-6 B, C)。25

小金海棠,低铁

图3-7-NAA/NPA处理下小金海棠根中A/xTV兄^A//V表达情况+Fe为正常供铁处理；-Fe为低铁处理；+NAA为施加NAA; +NPA为施加NPAFigure 3-7 Expression of NRAMPl in root of M xiaojinensis after NAA/NPA treatment+Fe means normal condition ； -Fe means low iron stress ；+NAA means add NAA； +NPA means add NPA

光分布,洋葱表皮,细胞定位,中亚

图3-11 MxNRAMPl蛋白在洋葱表皮中亚细胞定位分析A, B, C：转有pEZS-MxNRAVIPI的洋葱表皮细胞绿色‘艾光分布情况；D, E, F：转化对照质粒的洋葱表皮细胞的绿色W光分布愦况。Figure 3-11 Subcellular localization of the MxNRAMPl protein in onion epidermal cells

【参考文献】