适于快速高分辨成像的果蝇全脑样品制备方法研究

发布时间：2017-03-31 02:09

  本文关键词：适于快速高分辨成像的果蝇全脑样品制备方法研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：对果蝇(Drosophila melanogaster)全脑尺度神经解剖结构的快速、高分辨成像有助于理解脑功能和脑疾病的神经机制。传统的光学显微成像受限于轴向分辨率低,对果蝇脑的研究通常为平面内的亚微米分辨成像。新近出现的同步切片-成像技术,其典型代表如显微光学切片断层成像(micro-optical sectioning tomography, MOST),兼具快速成像和高空间分辨的的优势,为神经解剖学研究带来了新契机。本文为实现对果蝇全脑神经解剖结构的三维高分辨率成像,围绕如何建立适于同步切片-成像的果蝇全脑样品制备方法,以及发展细胞类型特异的果蝇全脑染色方法等问题开展了初步研究。 针对同步切片-成像的技术要求,开展了果蝇全脑样品制备方法的研究。有别于传统组织学方法先切片后染色的制备流程,本文样品制备的主要流程确立为固定、染色、脱水和包埋,染色和包埋是其中的关键步骤。对于染色方法,为获得果蝇全脑范围神经元的形态结构及相互关系,对Golgi法及其染色条件进行了研究和优化,实现了均匀、适度的全脑染色效果。对于包埋方法,为使样品具备适于连续微米切片的切削性能,选用了Spurr环氧树脂作为包埋介质,对果蝇全脑样品脱水和包埋的过程及条件进行了研究。综合上述研究结果,本文建立了一套完整的基于Golgi染色的适于同步切片-成像的果蝇全脑样品制备方法。 为弥补Golgi法标记的随机性缺陷,进一步发展了细胞类型特异标记的果蝇全脑样品制备方法。基于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)/二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine, DAB)显色的免疫酶标(immunoenzyme, IE)法能够描述特异类型神经细胞的精细解剖结构。然而,传统的HRP/DAB IE法染色深度较浅,仅用来显示薄切片或组织表层的细胞结构。本文对HRP/DAB IE法的实验条件进行了研究和优化,在果蝇全脑范围实现了均匀、高对比度的染色效果。结合已建立的样品制备流程及包埋方法,建立了细胞类型特异的适于同步切片-成像的果蝇全脑样品制备方法。 开展了果蝇全脑同步切片-成像的初步应用研究。利用MOST系统在细胞水平对果蝇全脑神经解剖结构进行了快速高分辨成像和三维数据集获取。基于Golgi法染色的果蝇全脑数据集,在全脑尺度对果蝇神经细胞及突起的形态结构进行了分析,发现了一些潜在的神经细胞类型和投射通路,如从触角叶皮层到小叶复合体的神经投射纤维,这为跨脑区信号处理通路的功能研究提供了解剖学依据。基于IE法染色的细胞类型特异的果蝇全脑数据集,在全脑尺度展示了果蝇五羟色胺能神经元的三维形态结构和精细神经突起信息,为五羟色胺能神经细胞的结构-功能研究提供了重要的实验对比数据。 综上所述,本文发展了一种快速、高空间分辨的获取果蝇全脑神经解剖结构的研究方法,为揭示果蝇全脑神经网络结构提供了重要研究手段,将在脑结构-功能关系的相关研究中发挥重要作用。
【关键词】：果蝇全脑 神经网络 Golgi法 免疫酶标法 同步切片-成像
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R384.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-11
• 英文缩写名称一览表11-14
• 1 绪论14-30
• 1.1 高分辨全脑结构的研究意义14-18
• 1.2 神经科学研究的理想模型——果蝇18-20
• 1.3 果蝇脑解剖结构的研究现状20-25
• 1.4 脑解剖结构测绘技术研究进展25-27
• 1.5 本文的研究目的和主要内容27-30
• 2 适于同步切片-成像的果蝇全脑样品制备研究30-55
• 2.1 适于同步切片-成像的果蝇全脑样品制备流程及关键步骤30-32
• 2.2 适于显示神经解剖结构的染色方法32-36
• 2.3 适于连续微米切片-成像的包埋及脱水方法36-39
• 2.4 Golgi法染色果蝇全脑样品制备的实验方法及材料39-46
• 2.5 果蝇全脑的Golgi法染色条件研究46-51
• 2.6 果蝇全脑的包埋及脱水条件研究51-53
• 2.7 本章小结53-55
• 3 细胞类型特异标记的果蝇全脑样品制备研究55-73
• 3.1 染色方法的选择及其关键技术问题55-63
• 3.2 IE法染色果蝇全脑样品制备的实验方法和材料63-69
• 3.3 果蝇全脑的IE法染色条件研究69-72
• 3.4 本章小结72-73
• 4 果蝇全脑同步切片-成像的初步应用研究73-94
• 4.1 果蝇全脑尺度神经解剖结构的细胞水平三维成像73-79
• 4.2 单神经元分辨水平的果蝇全脑尺度神经网络可视化79-89
• 4.3 果蝇五羟色胺能神经元的高分辨全脑图谱89-93
• 4.4 本章小结93-94
• 5 总结与展望94-99
• 5.1 主要内容与结论94-96
• 5.2 主要创新点96
• 5.3 研究展望96-99
• 致谢99-101
• 参考文献101-116
• 附录 攻读学位期间发表论文目录116

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本文编号：278631