海洋产黑色素短梗霉P16菌株产普鲁兰多糖的研究

发布时间：2020-08-31 22:08

　　普鲁兰多糖是一种线性葡聚糖,由重复的麦芽三糖单位经α-1,6糖苷键连接而成,是由短梗霉产生的水溶性同型胞外多糖,普鲁兰多糖中α-1,4糖苷键和α-I,6糖苷键相互交替,使其具有结构上的弹性和较强的水溶性。普鲁兰多糖在食品、医药、农业及化妆品等行业具有广泛的应用潜力。对100多株分离自红树林生态系统中的短梗霉菌株产胞外多糖能力进行筛选后,发现产黑色素短梗霉P16菌株产胞外多糖的能力最高。P16菌株产胞外多糖最适培养基中的碳源和氮源分别为120 g/1蔗糖和3 g/l酵母粉。在摇瓶培养条件下,120小时内胞外多糖浓度达65.3±2.1 g/l，细胞干重达18.7±0.38g/l。]0-1发酵罐分批发酵120小时,胞外多糖浓度达67.4±4.5 g/l，菌体量达23.01±0.12g/l,总糖剩余1.1%,还原糖剩余0.078%,并且发酵过程中不产黑色素。P16菌株所产的胞外多糖经过纯化后,可以被普鲁兰酶有效地水解；红外光谱检测分析发现,纯化的胞外多糖与普鲁兰多糖标准品的峰型一致,说明P16菌株所产的胞外多糖为普鲁兰多糖。这是对分离自红树林生态系统产黑色素短梗霉高产普鲁兰多糖的首次报道。在接下来的研究中,为了有效转化菊粉生产普鲁兰多糖,在P16菌株中高效表达了Kluyveromyces maximum KM菌株的INUI基因,通过对不同重组菌株利用菊粉产普鲁兰多糖能力的测定,发现重组菌株E136的菊粉酶酶活达40.92±1.08 U/ml,而原始菌株P16的菊粉酶酶活仅为7.57±0.29 U/ml；重组菌株EI36所产的菊粉酶大部分(99.27%)分泌到培养基中。利用含140 g/l菊粉的发酵培养基进行10-1发酵罐分批发酵,108小时内,普鲁兰多糖浓度达70.57±1.3g/l,菊粉酶活力于60小时达到最高,为42.03 U/ml,培养基中的菊粉被EI36菌株所产的菊粉酶有效地水解,大部分的还原糖被EI36菌株用于普鲁兰多糖的生产。P16菌株经过以上的遗传改造后,可以直接利用菊粉生产普鲁兰多糖。普鲁兰多糖合成酶基因PUL1与普鲁兰多糖的生物合成相关,对P16菌株中PUL1基因进行克隆及特征分析后发现,PUL1基因的ORF长592 bp,编码178个氨基酸,含有]段长55 bP的内含子。PUL1基因的启动子中含有1个CAAT box,1个TATA box和1段5’-HGATAR-3'序列,该基因编码的蛋白含有1段长18个氨基酸的信号肽,5个N-糖基化位点。对PUL1基因进行敲除后,发现敲除菌株DP108的普鲁兰多糖产量显著下降,为34.66±0.34g/l,说明PULl基因与普鲁兰多糖的合成相关。GFP-PUL1融合蛋白表达后,位于酵母细胞中的液泡表面,说明普鲁兰多糖的生物合成发生在酵母细胞的胞质中。在P16菌株中超表达了PUL1基因后,发现重组菌株G14所产的普鲁兰多糖浓度超过72.0g/1，而原始菌株P16在相同条件下的普鲁兰多糖浓度为67.4 g/1,说明普鲁兰多糖的产量由于普鲁兰合成酶基因的超表达而提高。纯化后的普鲁兰多糖分子量为4.422 x 105g/mol,并且分子量分布范围较窄。
【学位单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q936

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