利用基因编码的非天然氨基酸研究甲酸化及甲酰化赖氨酸翻译后修饰

发布时间：2020-09-14 08:26

【摘要】：近十几年来,基于基因密码子扩展的非天然氨基酸(UAA)技术得到了广泛的应用。通过这项技术,我们可以实现将目标UAA特异性地插入到目标蛋白的任意位点,其应用范围非常广阔,包括原核生物——细菌,真核生物——酵母、哺乳动物细胞、真核生物体(如线虫)、高等植物(如拟南芥)等。利用这种方法已经有超过100种的UAA被基因编码到不同的系统中,利用UAA本身的性质以及UAA与蛋白的相互作用实现了多种多样的用途,如蛋白的位点特异性标记,具有生物学意义的核磁、红外、FRET、荧光探针,改造并提高蛋白的酶活,向蛋白的特定位点引入翻译后修饰研究其功能等。UAA插入蛋白的特异性翻译系统依赖于吡咯赖氨酸氨酰tNRA合成酶(Py1RS)底物结合口袋对UAA的特异性识别作用,我们将底物结合口袋的关键位点进行随机突变,构建了Py1RS的突变库,通过正负筛选的策略筛选出能够识别目标UAA的氨酰tRNA合成酶,然后利用正交翻译系统将UAA插入到需要研究的蛋白的特定位点,进一步研究蛋白的性质或结构的变化。 C02的生物固定是地球上的生命赖以生存的基础,rubisco是固碳开尔文循环第一步反应中起催化作用的酶,同时也是固碳的限速步骤。其蛋白结构中存在一个重要的翻译后修饰——carbamate lysine(Kcx),起着固定并激活Mg2+的作用。我们首次通过UAA的方法研究了这一翻译后修饰的功能,并希望能够提高rubisco的酶活,进而提高光合作用的效率,达到增加粮食产量的目的。首先我们设计了一系列Kcx的结构类似物,通过引入苯酯保护或光保护的羧基保护基策略,找到了能够识别此UAA的Py1RS突变体,并且成功将Kcx结构类似物插入了rubisco蛋白的189位点,以模拟Kcx的作用。结果表明含有此Kcx结构类似物的rubisco活性几乎全部丧失,这说明Kcx对于rubisco的功能是不可或缺的,其侧链上氨基的作用可能比之前预想的更加重要。 甲酰化赖氨酸是一种新的翻译后修饰,广泛存在于真核生物染色体的组蛋白中。这种翻译后修饰可能对于染色质结构和基因表达的调控具有重要作用,但并未得到详细的研究,原因之一在于缺乏位点特异性地将甲酰化赖氨酸引入特定蛋白的方法。我们首次通过人工筛选的方法进化出了能够识别甲酰赖氨酸的Py1RS克隆,通过基因密码子扩展的方法将甲酰赖氨酸引入到了组蛋白H3的特定位点,实现了在细菌和哺乳动物细胞中甲酰赖氨酸密码子的扩展。另外,我们测试了抗体对于乙酰赖氨酸和甲酰赖氨酸识别的异同,发现识别乙酰赖氨酸的抗体不识别甲酰赖氨酸,这表明两种翻译后修饰可能存在功能上的差异。我们的研究为开展甲酰赖氨酸翻译后修饰功能的研究提供了强有力的工具,对于组蛋白表观遗传学的研究具有重要意义。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q517;Q78

【共引文献】

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本文编号：2817943