低浓度喹诺酮对嗜热链球菌生理特性及蛋白组表达的影响研究

发布时间：2020-09-16 18:14

　　近年来,低浓度抗生素残留在许多动物源性食品原料中存在。当这些原料被用于生产发酵食品时,其中残留的抗生素就会对作为发酵剂的乳酸菌产生一定的胁迫作用。同样当人们在服用抗生素进行治疗疾病期间,人体内的以及外源补充的乳酸菌也会受到抗生素的胁迫作用。在低浓度的抗生素作用下,为了阻止有害物质进入胞内,乳酸菌会产生一系列的应激反应。此时会对乳酸菌的生理特性和发酵性能产生怎样的影响,是否有不良代谢产物的产生,都需要进行深入研究。本论文利用微生物生理学和蛋白质组学的研究手段,研究了嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus, S. thermophilus) grx02在低浓度喹诺酮作用下其生理特性、发酵性能及蛋白组表达的变化,从而为全面、客观评价乳酸菌的益生特性和安全性提供理论依据。1.低浓度喹诺酮对S. thermophilus grx02生理特性的影响测定了氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)和环丙沙星(Ciprofloxacin, CPFX)对S. thermophilusgrx02的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC),然后将S. thermophilusgrx02分别接种于加入0、1/2、1/10和1/50 MIC的OFX和CPFX的MRS液体培养基中,测定其生长曲线的变化,分别以光镜和电镜进行形态学观察,并测定对细胞膜通透性和胞内乳糖代谢关键酶活性的影响。结果显示：S. thermophilus grx02对OFX和CPFX的最小抑菌浓度分别为7.75μg/mL和3.89μg/mL,均为中度敏感。在1/2MIC的OFX和CPFX作用下,S. thermophilus grx02的生长速度均显著降低(P0.05)。在不同亚抑菌浓度的OFX和CPFX作用下,S. thermophilus grx02中的小菌落、微菌落数明显增多。通过透射电镜观察发现对照组的菌体呈长椭圆形,而各药物组的菌体长度随着药物浓度的升高而明显变短。对照组的荚膜较厚,比较松散,而药物组的荚膜明显的变得薄而致密,将细胞紧紧包裹住。当OFX和CPFX的浓度达到1/10MIC时,S. thermophilus grx02的细胞膜通透性就会显著降低(P0.05)。当OFX和CPFX的浓度达到1/2 MIC时,S. thermophilus grx02胞内的β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶活力均显著降低(P0.05); 1/50 MIC的OFX对β一半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶活力的影响不大,1/50MIC的CPFX对卢一半乳糖苷酶活力影响也不大,但使乳酸脱氢酶活力反而增大。上述结果表明,在低浓度喹诺酮的作用下,S. thermophilus grx02启动了相应的应激机制,其生理特性也发生了一系列复杂的变化。2.低浓度喹诺酮对S. thermophilus grx02发酵性能的影响研究了不同亚抑菌浓度的喹诺酮对S. thermophilus grx02的凝乳时间、产酸能力、产黏能力和蛋白水解能力的影响,以及对S. thermophilus grx02发酵乳的质构特性、流变特性、感官特性、活菌数和挥发性风味物质的影响。结果显示：当原料乳中OFX和CPFX的残留量达到1/2 MIC,会使S. thermophilus grx02发酵乳的脱水收缩性显著增大,粘附性、胶黏性和咀嚼性显著降低,蛋白水解能力显著降低,同时使S. thermophilus grx02发酵乳在贮藏期间的活菌数显著降低(P0.05)。当原料乳中OFX和CPFX的浓度达到1/10 MIC时,会延长Sthermophilus grx02发酵乳的凝乳时间,使S. thermophilus grx02发酵乳的产酸速率和黏度显著降低(P0.05),使其在贮藏期间的稳定性明显降低；会对S. thermophilus grx02发酵乳的流变特性产生显著影响,使其凝胶稳定性降低,抗机械运动和温度变化的能力降低；会对thermophilus grx02发酵乳的感官质量产生显著影响,发酵乳出现了少量乳清析出,且稠厚感变差,其组织状态得分显著低于其他组(P0.05)。当OFX和CPFX残留量达到1/50 MIC时,会使发酵乳中挥发性风味物质的总质量分数明显降低,主要风味化合物双乙酰类物质的质量分数也降低,且有机酸的含量也发生了明显的变化。综合上述研究结果,我们认为用于发酵乳制品生产的原料乳中OFX和CPFX的残留限量应该控制在1/50 MIC以下。3.低浓度氧氟沙星对S. thermophilus grx02蛋白质组表达的影响利用双向凝胶电泳技术(2-DE),比较了S. thermophilus grx02分别在空白和龠有1/2MIC OFX的MRS液体培养基中生长至对数生长期中期的蛋白质组表达差异,并利川基质辅助光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对表达差异的蛋白质进行了鉴定,最后对差异蛋白的功能分类进行了解析。实验结果表明：通过2-DE得到了背景清晰、分辨率较高、重复性较好的S. thermophilus grx02的蛋白组图谱。在1/2MIC OFX作用下订47个蛋白点的表达发生显著变化,其中可以鉴定出的蛋白质有38个,有5种蛋白质在1/2MIC氧氟沙星作用下不表达,其中包括了冷激蛋白CspA、通用应激蛋白Gls 39、Fl-ATP合成酶、尿嘧啶磷酸核糖转移酶和硝基还原酶。有30种蛋白质表达发生了下调,它们分别参与了糖代谢和能量代谢、蛋白质的合成、核苷酸的合成、DNA合成、转录和翻译的调节等。有3种蛋白质的表达发生了上调,均为通用应激蛋白。上述结果表明,1/2MIC的氧氟沙星会对S. thermophilus grx02的蛋白质表达产生显著地影响,使许多代谢途径酶的活性受到抑制,从而降低乳酸菌的生长和代谢速度。同时诱导一些通用应激蛋白表达的上调,以提高细胞对低浓度抗生素的抵御能力。这些都是S. thermophilus grx02抵御低浓度抗生素胁迫的应激机制之一。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：

生长曲线,生长曲线,最小抑菌浓度,相关标准

．ｘｆｆ逡逑式中：Ｖａ为反应总体积／ｍｋ邋Ｖｆｆ为样品体积／ｍＬ逡逑ＡＯＤｗｏｕｍ为每分钟光密度的降低值。逡逑３结果与分析逡逑３．１幢诺酉同对＆邋ｆ片ｅｒｗｏｐＭｗ邋ｇｒｘ０２的最小抑菌浓度逡逑最小抑菌浓度（ＭＩＣ）可准确地反映试验菌株对抗生素的敏感程度。测定了公逡逑ｇｒｘ０２对氧l#沙星的最小抑菌浓度为７Ｊ５邋Ｕ邋ｇ／ｍＬ，对环丙沙星的最小抑菌浓３．８９ｕｇ／ｍＬ，参照ＮＣＣＬＳ的相关标准町说明Ｓ祝ｍｗ；７／ｎ７ｗｇｒｘ０２对氧l#沙星和环丙均属于中度敏感。逡逑．３．２不同浓度喧诺酉同对Ｓ逦ｇｒｘ０２生长特性白勺影口向逡逑对照组及分别加入了邋１／２ＭＩＣ、１／１０ＭＩＣ和１／５０ＭＩＣ的ＯＦＸ和ＣＰＦＸ的Ｓ．说ｅｒｗｏｐ片！逡逑ｘ０２生长曲线如图２－１、图２－２所示。逡逑．

照片,透射电镜,对照组,圆形

Ｎ逦、逡逑（ｆ）邋１／５０ＭＩＣ邋ＣＰＦＸ逡逑图２－３不同浓度哇诺r>作用下Ｓ．邋／Ａｅｗｚｏｐ／ｎ’／ｗ邋ｇｒｘ０２的光镜（４０0ｘ）照片逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｐｈｏｔｏｓ（４０0ｘ）邋ｏｆ邋Ｓ．邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ邋ｇｒｘ０２邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ逡逑由图２－３可Ｗ看出，在光学显微镜（４００叫下，对照组Ｓ．化ｅｎｍ？；加７ｗｇｒｘ０２的菌落呈长链逡逑状，聚集在一起，而不同浓度的ＯＦＸ和ＣＰＦＸ作用下，Ｓ．化ｅｒｗｏｐＭｗｇｒｘ０２普遍形成，其中逡逑１／２ＭＩＣ组的最为明显，有许多分散的单个菌落。说明有亚抑菌浓度的抗生素存在时，会逡逑对／／ｚｅｒｗｏ如化ｇｒｘ０２的细胞产生一定刺激作用，使得细胞表面的相互吸附能力被破坏，逡逑从而分散成小菌落和微菌落。逡逑２．３．３．２透射电子显微镜下的观察结果逡逑不同浓度ＯＦＸ和ＣＰＦＸ作用下的＆从ｅｎｗｏｐＷ／ｗ邋ｇｒｘ０２电子显微镜拍摄照片如图２－４所示。逡逑

发酵乳,氧氟沙星,凝乳,样品

表３－２y乳时间测定结果（ｈ）逡逑了ａｂｌｅ邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｍｅａｓｉｎ邋ｅｄ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｃｕｒｄ邋ｔｉｍｅ邋（邋ｈ邋）逡逑唾诺哪浓度逦氧氮沙星逦环丙沙星逡逑对照组逦４．０逦４．０逡逑１／２ＭＩＣ逦５．５逦６．０逡逑１／１０ＭＩＣ逦４．５逦４．５逡逑１／５ＱＭ１Ｃ逦＾逦４＾逦逡逑由表３－ｌ可Ｗ看出，当ＯＦＸ和ＣＰＦＸ的残留量为ｌ／１０ＭＩＣ和ｌ／２ＭＩＣ时，＆／／＾ｍ７ｗ如リｗ逡逑ｇｒｘ０２发酵乳的凝乳时间均比对照组和１巧０邋ＭＩＣ组明显延长，而＾５０邋ＭＩＣ组与对照组凝乳时逡逑间相同。说明当氧l#沙星和环丙沙星的质量浓度达到１／１０邋ＭＩＣ时，就会对乳酸晵的生长产逡逑生一定的抑制作用，使其产酸的明显速度降低，从而延长发酵乳的凝乳时间。逡逑３．３．３不同浓度喧诺酉同对Ｘ逦片术＂ｇｒｘ０２产黏能力的影口向逡逑在发酵及４’Ｃ储贼期间各发酵乳样品的黏度变化如图３－３、３－４所示。逡逑

【参考文献】