三价金属离子及其配合物对MMPs抑制作用及机制研究

发布时间：2017-04-02 13:13

  本文关键词：三价金属离子及其配合物对MMPs抑制作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基质金属蛋白酶（MMPs）是由细胞分泌的含有锌金属离子催化中心的肽链内切酶。MMPs除了能够降解细胞外基质（ECM）和基底膜外，它们在调控细胞因子、生长因子、激素和细胞粘附分子受体等的合成和分泌中发挥重要作用，进而参与发育、进化、形态发生、组织重塑、血管新生、关节炎、心血管疾病、中风、多发性硬化症、神经退行性疾病、过敏以及癌症等一系列生理和病理过程。其中MMP-2、-13、-14分别属于明胶酶类、胶原酶类以及膜型MMPs，它们具有不同的底物降解特异性，能够降解不同类型胶原和明胶，参与了需要ECM重塑的多个生理或病理过程，其过量表达与肿瘤恶化过程中癌细胞的迁移、浸润和转移密切相关。 金属离子在许多生物过程中发挥重要作用，如细胞呼吸、信号转导、存储和新陈代谢。作为催化酶或维持蛋白质结构功能的活性中心发挥生物功能。破坏金属离子体内平衡涉及很多疾病。但金属药物在临床用于治疗各种疾病。并且随着研究的深入，发现三价金属及配合物如澜系等具有多种生理功能，并且具有抗菌、抗病毒、抗癌活性。 在前期工作中，我们对关白附中抑制MMPs的有效成分研究中发现，NH4Al(SO4)212H2O对MMP-2、-9抑制的IC501μM，而(NH4)2SO4，K2SO4对MMPs无明显抑制，推断其抑制作用的活性基团是三价铝。同时，在对细胞的存活能力不产生影响的浓度下，NH4Al(SO4)212H2O显示了对HT-1080细胞浸润和迁移能力的剂量依赖性抑制。我们进而分析了几种三价的金属离子、三价金属的配合物如Fe2(SO4)3、FeCl3、NH4Fe(SO4)2以及K3[Fe(CN)6]对MMP-16的抑制作用，发现这几种三价金属盐或其配合物对MMP-16的活性、细胞的迁移和侵袭能力均有比较显著的影响。在这些发现的基础上，进一步探讨众多三价金属离子、三价金属离子的配合物对MMPs的抑制是否具有普遍性、对MMPs家族成员的抑制是否具有特异性、抑制MMPs活性的分子机制、对其它蛋白酶家族的成员是否也存在一定的抑制作用，这是本论文试图回答或部分回答的主要问题。 在本研究中，我们选择了12种具有代表性的三价金属离子及其配合物，分析了对三种不同类型的重组MMPs，MMP-2、-13、-14的抑制作用。结果表明，澜系的LaCl3、TbCl3、GdCl3、YbCl3、EuCl3对MMP-2、-13以及-14均有不同程度的抑制作用，IC5010μM左右。K3[Fe(CN)6]、FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)212H2O四种试剂对三种MMPs的酶活抑制IC5010μM，，K3[Fe(CN)6]抑制效果尤为显著，IC50分别为2.2μM、0.88μM、0.05μM。其他三价金属离子化合物YCl3、HAuCl4、NaAuCl4对的三种MMPs的IC5010μM，HAuCl4对MMP-14抑制效果尤为显著，IC50值为0.3μM。同时，终浓度为10μM的K3[Fe(CN)6]、FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)2、LaCl3、EuCl3、TbCl3、GdCl3、YCl3、YbCl3、HAuCl4、NaAuCl4对Cathepsin （组织蛋白酶）K、L均无明显抑制，但对于Cathepsin B有抑制，而K3[Fe(CN)6]与HAuCl4对上述三种Cathepsin均无明显抑制。另外，我们发现CaCl2、NiCl2、MnCl2、ZnSO4、CoCl2、NiCl2等二价金属离子在100μM对三种MMPs并不抑制。上述结果表明，三价金属及其配合物对MMPs具有普遍的抑制作用，而K3[Fe(CN)6]与HAuCl4对MMPs家族的MMP-14具有特异性抑制作用。另外，三价金属及配合物对HT-1080细胞活力的作用分析表明，FeCl3、AlCl3、NH4Al(SO4)212·H2O、LaCl3、EuCl3、TbCl3、GdCl3、YCl3、YbCl3降低细胞活性的IC50值均大于350μM。并且，我们发现在0-350μM随着化合物浓度的增加，并没有明显的细胞毒趋势，而浓度大于350μM时，细胞活力骤然降低，推测可能是由于细胞对于这些三价离子的通透性突然增强，从而进入细胞中最终导致细胞死亡，细胞活力下降。 我们随后选取了对MMP-14具有特异性抑制，并且抑制效果较强的K3[Fe(CN)6]，分析了其对MMP-14抑制机制及抑制类型。并进一步检测了K3[Fe(CN)6]对肿瘤细胞行为的影响，最后对调节细胞行为的机制进行了初步探讨。酶动力学分析表明，K3[Fe(CN)6]在终浓度0-0.06μM范围内对MMP-14的抑制为可逆抑制机制。通过Michaelis-Menten方程、Lineweaver-Burk方程以及Dixonplots作图表明，当抑制浓度为0.0157μM时，Km不变，Vmax变小，属于非竞争性抑制，但随着浓度增加为0.0313μM、0.0625μM时Km变小，Vmax变小，属于非竞争与反竞争混合型抑制类型。表明底物和抑制剂可以同时与酶结合，形成的中间三元复合物影响酶的构象和催化能力，因此酶活力降低。同时，我们发现了K4[Fe(CN)6]对MMP-14具有显著地抑制作用以及一致抑制机制，比较其他活性基团发现抑制的活性中心为Fe-CN的配合物。进一步细胞实验表明，在不影响细胞活力的浓度下，K3[Fe(CN)6](0-50μM)对肿瘤细胞HT-1080的迁移和侵袭具有显著抑制作用。免疫印迹实验表明，0-50μM的K3[Fe(CN)6]抑制细胞的浸润和迁移，可能与对MMP-14表达的下调相关。进一步实验表明，K3[Fe(CN)6]对HT-1080细胞中Erk1/2、-catenin、P-JNK、FAK蛋白表达下调，推测可能是通过对上述的蛋白调控，进而抑制了细胞的迁移和侵润。具体的调控机制与信号传递有待进一步研究。 最后，我们针对HAuCl4对MMP-14的特异性抑制机制及类型进行了分析。并进一步分析了其对肿瘤细胞行为的影响。结果表明，HAuCl4对MMP-14的抑制机制为可逆抑制。Michaelis-Menten方程作图以及Lineweaver-Burk方程和Dixon plots作图表明，随着浓度增加，Km不变，Vmax变小，HAuCl4在0-0.6μM浓度范围内对MMP-14抑制属于非竞争抑制，即底物和HAuCl4对MMP-14的作用不存在竞争的关系，MMP-14与底物或者HAuCl4结合都不影响与另外一个的结合，形成的中间三元复合物可能影响酶的构象和催化能力，因此导致酶活力降低。并且作用的部位为活性部位以外的基团，其结构与底物无共同之处，不能通过增加底物浓度来解除抑制。细胞实验表明，HAuCl4在不影响细胞活力的浓度下0-50μM，对肿瘤的迁移和侵袭具有显著抑制作用。提示HAuCl4可能通过抑制MMP-14活性进而对肿瘤细胞行为起作用。进一步发现，NaAuCl4尽管也显示对基质金属蛋白酶MMP-2、13、14具有抑制作用，并且对组织蛋白酶不抑制，但与HAuCl4相比抑制作用较弱，尤其是对MMP-14，失去了抑制的选择性。另外，NaAuCl4对HT-1080细胞活力影响的IC50较高，在和HAuCl4同样浓度下，表现出了促进细胞侵袭的现象。对于造成这一差异的原因还需进一步研究。 综上所述，本论文首次发现并证实了，三价金属离子及配合物对MMPs具有普遍的抑制作用，且抑制IC50在微摩尔级，这种抑制可能通过调节MMPs的功能进而调节MMPs参与的相关生理病理性活动。以往的MMPs抑制剂的研究都局限在有机分子的范围内，我们的发现对MMPs抑制剂研究范围的扩展具有重要的理论意义。并且其中K3[Fe(CN)6]和HAuCl4两种化合物对MMP-14均具有特异性的抑制作用，抑制机制分别为非竞争-反竞争混合型可逆性抑制、非竞争性抑制，表明两者是通过与MMP的非活性中心结合，可能通过改变其结构、构象进而实现抑制的，对此目前尚未有报道。最后我们还发现了K3[Fe(CN)6]与HAuCl4能够对肿瘤细胞HT1080的细胞行为的影响，尤其是K3[Fe(CN)6]，可能通过抑制MMP-14的活性和表达以及肿瘤相关的多种信号蛋白而抑制肿瘤的迁移和侵袭。综上，本论文的研究对于了解三价金属离子及其配合物在调节MMPs的活性，调节MMPs参与的相关生理病理活动中的作用具有重要的意义。
【关键词】：基质金属蛋白酶 三价金属离子及其配合物 抑制机制 肿瘤
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 第一章 绪论16-50
• 1 基质金属蛋白酶16-38
• 1.1 基质金属蛋白酶家族简介16
• 1.2 基质金属蛋白酶结构及分类16-19
• 1.3 MMPs 的活化与调控19-23
• 1.3.1 转录调节19-21
• 1.3.2 酶原形式 MMPs 的活化21-22
• 1.3.3 MMPs 活性的激活与抑制22-23
• 1.4 MMPs 的生理与病理作用23-36
• 1.4.1 MMPs 的生理功能23-26
• 1.4.2 MMPs 与肿瘤26-31
• 1.4.3 MMPs 与非肿瘤相关疾病31-36
• 1.5 MMPs 抑制剂36-38
• 2 金属离子及配合物38-47
• 2.1 金属离子生物功能38-39
• 2.2 金属离子与疾病39-40
• 2.3 金属及其配合物药物发展40-41
• 2.4 三价金属及配合物41-47
• 2.4.1 铁铝及其配合物41-44
• 2.4.2 澜系及其配合物的生物功能44-45
• 2.4.3 其他三价阳离子化合物及其配合物45-47
• 3 本论文研究目的和策略47-50
• 第二章 材料与方法50-60
• 1 材料50-53
• 1.1 菌种与细胞株以及抗体50
• 1.2 仪器50
• 1.3 试剂50-53
• 1.3.1 包涵体分离纯化试剂50-51
• 1.3.2 SDS-PAGE 电泳试剂51-52
• 1.3.3 银染试剂52-53
• 1.3.4 包涵体处理试剂53
• 2 方法53-60
• 2.1 重组蛋白 MMP-2，-13，-14 的表达、纯化及复性53-54
• 2.1.1 重组蛋白 MMP-2，-13，-14 的诱导表达53-54
• 2.1.2 包涵体的分离和洗涤54
• 2.1.3 包涵体的溶解54
• 2.1.4 重组蛋白 MMP-2，-13，-14 包涵体的纯化54
• 2.2 金属离子及其配合物对 MMPs 酶活力影响54-55
• 2.2.1 金属离子及其配合物对 MMPs 活性的影响54-55
• 2.2.2 金属离子及其配合物对组织蛋白酶 B、K、L 活性的影响4055
• 2.2.3 酶活性的抑制 IC50测定55
• 2.3 酶动力学分析55-56
• 2.3.1 酶活性抑制机制分析55-56
• 2.3.2 抑制剂对酶的抑制类型分析56
• 2.4 细胞培养56-57
• 2.4.1 细胞复苏56
• 2.4.2 细胞传代56
• 2.4.3 细胞冻存56-57
• 2.5 细胞活力检测（MTT 法）57
• 2.6 细胞迁移实验（划痕法）57
• 2.7 细胞侵袭试验57-58
• 2.8 免疫印迹58-60
• 第三章 结果与讨论60-104
• 1 三价金属离子及其配合物对MMPs的抑制作用60-80
• 1.1 三价金属及其配合物对重组蛋白酶 MMP-2、-13、-14 的 IC50测定60-76
• 1.1.1 重组蛋白酶 MMP-2、-13、-14 的活性鉴定60-62
• 1.1.2 几种澜系金属化合物对 MMP-2、-13、-14 酶活性抑制62-65
• 1.1.3 三价铁及铝化合物及其配合物对 MMP-2、-13、-14 酶学抑制（IC50）65-68
• 1.1.4 其他三价金属及其配合物对 MMP-2、-13、-14 酶活性抑制（IC50）68-76
• 1.2 三价金属离子及配合物对 HT-1080 细胞活力的影响76-78
• 1.3 小结78-80
• 2 K_3[Fe(CN)_6]对MMP-14的抑制机制研究80-94
• 2.1 K_3[Fe(CN)_6]对 MMP-14 的抑制机制与类型80-84
• 2.2 K_3[Fe(CN)_6]抑制 MMP-14 酶活力的活性基团分析84
• 2.3 K_3[Fe(CN)_6]对 HT-1080 细胞活力的影响84-86
• 2.4 K_3[Fe(CN)_6]对 HT-1080 细胞迁移能力的影响86-87
• 2.5 K_3[Fe(CN)_6]对 HT-1080 细胞侵袭能力的影响87-89
• 2.6 K_3[Fe(CN)_6]对 HT1080 细胞中 MMP-14 表达的影响89-90
• 2.7 K_3[Fe(CN)_6]对多种细胞信号蛋白的影响90-92
• 2.8 小结92-94
• 3 HAuCl_4对MMP-14酶活性抑制作用及机制研究94-100
• 3.1 HAuCl_4对 MMP-14 抑制机制与抑制类型94-96
• 3.2 HAuCl_4对 HT-1080 细胞活力的影响96-98
• 3.4 HAuCl_4对 HT-1080 细胞侵袭能力的影响98-99
• 3.5 小结99-100
• 4 结论100-104
• 参考文献104-128
• 作者简介及攻读博士期间所取得的科研成果128-130
• 致谢130

【共引文献】

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